实验一 溶菌酶溶菌作用

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1、实验一溶菌酶的溶菌作用实验目的：1、掌握溶菌酶对革兰氏阳性菌溶解的原理及应用。2、证实体液中溶菌酶的存在观察溶菌酶的溶菌现象。基本原理：正常情况下，机体的唾液、泪液、痰、鼻腔分泌物以及白细胞和血清等均含有丰富的溶菌酶。测定分泌物和体液中的溶菌酶含量及其变动情况，可作为评价机体非特异性免疫功能的指标之一。溶菌酶的杀菌机理是其作用于细菌细胞壁的粘肽层，粘肽是细菌的细胞壁主要成分。溶菌酶能切断粘肽结构中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键，破坏粘肽支架，使细胞壁破坏。由于细菌细胞壁的重要功能之一是保护细菌，即抗低渗，故细菌失去细胞壁的保护作用后，在

2、低渗环境中可发生溶解。溶菌酶的主要作用对象是革兰氏阳性菌。革兰氏阴性细菌细胞壁粘肽层外还有脂多糖、外膜和脂蛋白结构，故在一般情况下溶菌酶不易发挥直接作用。实验材料：1、葡萄球菌：本菌是一种革兰氏阳性菌，普通琼脂培养基生长良好。2、标准溶菌酶：称取溶菌酶标准纯品，用蒸馏水配制为1000ug/ml原液，并稀释为100、50、10ug/ml标准液，用前保存在冰箱中。3、唾液：用无菌平皿收集唾液，可在同学间收集。（于饭后两小时，清水漱口3次，10分钟后，收集唾液于清洁烧杯中）；4、其它：无菌打孔器（孔径2mm），无菌毛细吸管、毫米尺等。实验方法：1、制备含葡萄球菌的琼脂

3、平板加热融化3%琼脂，冷至60℃~70℃时，加入1ml葡萄球菌菌液，混合均匀，倾注于无菌平皿内。2、用无菌打孔器在葡萄球菌琼脂平板上打孔，孔径2mm左右，孔距5-20mm。用针头挑出孔内琼脂，3、用毛细吸管取新鲜收集的唾液加入琼脂孔内，每孔加满唾液,同时加标准溶菌酶作阳性对照。4、置24-28℃下12-18h观察结果。观察各孔周围溶菌情况，测量溶菌环直径。实验结果：用毫米尺或三角板量取小孔周围溶菌环直径，并作记录，可与标准溶菌酶阳性对照作对比观察。机体的免疫功能是由免疫系统完成的，免疫系统由免疫器官（中枢免疫器官和外周免疫器官），免疫细胞（T细胞（胸腺依赖性淋巴

4、细胞）、B细胞（骨髓依赖性淋巴细胞）、K细胞、NK细胞、LAK细胞、TIL细胞和单核巨噬细胞）和免疫分子（免疫球蛋白、补体、细胞因子等）等组成。（1）中枢免疫器官胸腺：T细胞分化成熟的场所。骨髓：是多种血细胞的发源地，也是B细胞、单核吞噬细胞、粒细胞、血小板和红细胞分化成熟的场所。法氏囊：禽类B细胞分化成熟的场所。功能：是免疫细胞发生、分化和成熟的场所。（2）外周免疫器官：淋巴结、脾脏和扁桃体、阑尾、肠壁集合淋巴结和消化道、呼吸道粘膜下层的淋巴小结。功能：是成熟的T、B淋巴细胞定居的场所，也是发生免疫应答的重要部位。免疫细胞：凡参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞

5、统称为免疫细胞。包括：造血干细胞、淋巴细胞、单核吞噬细胞、粒细胞、红细胞。免疫细胞泛指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞及前体细胞，主要包括造血干细胞、T、B淋巴细胞、NK细胞、单核吞噬细胞、粒细胞、红细胞、肥大细胞、单核-巨噬细胞和树突状细胞。免疫分子包括抗体、补体、细胞因子、主要组织相容性抗原和分化群等。1、抗体(antibody，Ab)：免疫系统受抗原刺激以后，B细胞转化为浆细胞，由浆细胞产生能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白称抗体。它们与相应抗原特异性结合后，并在补体、吞噬细胞和NK细胞参与下，产生溶菌、促进吞噬杀菌的调理作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒

6、作用。2、补体（complement）：存在于人和动物的正常血清中，与免疫有关，具有酶活性的蛋白质。在生理状态下，补体各成分以酶原或非活性的状态存在与体液中，只有被某些物质(如抗原抗体复合物)激活后，才能表现出细胞溶解、促进吞噬的调理作用、免疫调节作以及释放炎症介质参与炎症反应等作用。3、细胞因子（cytokine，CK）是由多种细胞，特别是活化免疫细胞合成分泌的一类具有多种生物学活性的小分子蛋白。细胞因子在免疫细胞分化发育、免疫应答及其调节、炎症反应和组织修复等过程中发挥重要的作用。