益肾活血提取液对oxldl诱导的人脐静脉内皮细胞cd40、mmp

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1、益肾活血提取液对oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞CD40、MMP：刘桂林1张继东窦迎春2王博任敏乔云【摘要】目的观察益肾活血提取液对氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)CD40、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达的影响。方法原代培养HUVECs，取3~5代细胞用于试验，提取细胞RNA及蛋白。采用实时定量RT-PCR检测HUVECsVCAM-1mRNA表达，采用MP-9的蛋白表达变化。结果刺激组CD40、MMP-9及VCAM-1的表达较空白组明显升高(1.48±0.34vs0

2、.45±0.16;1.54±0.16vs0.62±0.12，12.82±0.16vs1.00±0.01,P均<0.001)，大、中、小剂量的益肾活血提取液可以不同程度地抑制oxLDL诱导的HUVECs、CD40、MMP-9及VCAM-1的高表达。结论益肾活血提取液具有改善内皮细胞功能的作用，其机制与抑制oxLDL诱导的HUVECsCD40、MMP-9及VCAM-1的高表达有关。【关键词】益肾活血提取液;氧化型低密度脂蛋白;白细胞分化抗原;基质金属蛋白酶-9;血管细胞黏附分子-1　目前认为动脉粥样硬化(AS)是一多因素、多基因引起的复杂的慢性

3、炎症性疾病。氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)引起的内皮损伤与激活参与了AS的形成。白细胞分化抗原40(CD40)与CD40配体的相互作用参与了AS斑块的形成与破裂，在斑块内炎症反应过程中起重要作用〔1~3〕。血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)通过与配体相互作用参与T细胞-T细胞、T细胞-基质杀伤细胞-靶细胞之间的相互作用,与AS过程中炎症免疫反应密切相关〔4〕。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)可降解血管壁的胶原纤维，弹力蛋白，玻璃体结合蛋白等，促进斑块的形成、不稳定与破裂。益肾活血提取液以益肾活血为组方原则，佐以化痰祛瘀，临床研究证实其有降低冠

4、心病患者血清内皮素、肿瘤坏死因子α水平，升高一氧化氮水平的作用〔5〕,为进一步阐　明其抗AS作用的机制，本研究观察了益肾活血提取液对oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)CD40，MMP-9及VCAM-1表达的影响。　　1材料与方法　　1.1主要试剂M199干粉培养基，美国Gibco公司生产。胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司。胰蛋白酶，美国Sigma公司生产。重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液(贝复济)，珠海亿胜生物制药有限公司。4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，上海碧云天生物技术有限公司。oxLDL,广州中山大学提供。兔抗

5、小鼠/人CD40多克隆抗体，兔抗小鼠/人MMP-9多克隆抗体，兔抗人/小鼠CD31单克隆抗体，均为英国Abcam公司产品。兔抗人/小鼠/大鼠β-actin多克隆抗体，美国SantaCruz公司产品。山羊抗兔IgG二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司产品。Trizol，美国Invitrogen公司生产。RNA反转录试剂盒和SYBRPremixExTaqTMDRR041S试剂盒，TaKaRa大连宝生物工程有限公司。DNAMarker，北京天根生化公司产品。蛋白裂解液(RIPA)和二辛可宁酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司。脱脂

6、奶粉，黑龙江省完达山乳业股份有限公司。硝酸纤维素膜，0.2μm孔径，美国Invitrogen公司产品。预染蛋白质Marker，北京天根生化公司产品。放射自显影胶片，美国AmershamhamaciaBiotech公司产品。其余试剂为国产或进口分析纯。　　1.2方法　　1.2.1益肾活血提取液制备药物组成：枸杞、丹参、生黄芪、黄精、川芎、水蛭、瓜蒌皮、大黄、黄连。以上生药材由　济南建联药材公司提供。生药材经过二次干燥之后，按处方比例混匀，室温下加入蒸馏水浸渍1h;煎煮两次，每次煎煮1h;将过滤后的滤出液混合，之后两次醇沉，再行水提，浓缩成含生药1g

7、/ml的药液，-20℃保存，稀释使用。　　1.2.2HUVECs原代培养无菌获取健康剖宫产妇新生儿脐带15~20cm,剪去钳痕，以PBS冲洗脐静脉管腔。将脐带的一端用止血钳夹闭，注入0.125%胰蛋白酶消化液于超净台上室温消化10~13min。用无菌空针将消化液抽出，置于离心管内，再以PBS冲洗管腔，洗出液置于离心管内，加入2ml胎牛血清终止消化。1000r/min,离心8~10min。于超净台内将离心管内的上清液倒掉，以全培养基(M199+20%胎牛血清+3%重组牛碱性成纤维细胞生长因子+1%HEPES)将细胞悬浮，转移至25cm2的培养瓶内，

8、置于37℃,5%CO2孵箱中培养，12~24h后换液，清除未贴壁细胞，以后每3~4d换液一次。见图1。　　1.2.3细胞传代待原代细胞融