冷冻切片技术在植物病害诊断中的应用

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1、冷冻切片技术在小麦病原真菌研究中的应用姚娟妮1，成玉林1,2，张国云1*1西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西，杨凌712100；2西北农林科技大学生命科学学院，陕西，杨凌712100摘要本文利用冷冻切片技术研究了条形柄锈菌小麦专化型（Pucciniastriiformisf.sp.tritici）和禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）两种病原真菌分别在侵染小麦叶片和穗部侵染过程中的发育结构。显微镜下观察发现：病原真菌结构清晰，植物组织和细胞形态完整，对比度良好，并且可观察到新鲜植物组织

2、、病原真菌结构的天然色彩和活体细胞的结构状态。比起传统的切片技术制样过程复杂，制作周期长等缺点，冷冻切片技术不经过脱水和透明等步骤，快速简便，易操作。该方法为植物病原真菌的研究提供了一个快速观察和研究的方法，建议在实验教学和科学研究中推广应用，为教学和科研服务。关键词冷冻切片技术；条形柄锈菌小麦专化型；禾谷镰刀菌；植物真菌病害；组织学植物病害是严重危害农作物生产的自然灾害之一。由植物病原真菌引起的病害约占植物病害的70～80％。许多病原真菌寄生于植物组织内，只有通过制作显微切片，观察其形态特征，才能对其进行系统研究，从而

3、搞清楚其生物学特性和发生规律，为防治措施的制定提供科学依据。组织切片技术是植物病理研究中观察病原真菌形态的常用方法。冷冻切片技术属于组织切片技术中的一种，是利用低温使组织迅速冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法。与常规的石蜡切片相比，冷冻切片因其不经过脱水和透明等步骤，具有快速简便、易操作，易保持生物体细胞的原有形态等特点，该技术在医学上应用的比较多。近年来在植物上的研究也逐渐多起来，且常常集中在植物器官结构的研究，比如高度木质化材料（林月惠等，2001）、植物花器官（陈丹和赵洁，2005）和植物微管骨架（张新成等，20

4、08），也有植物组织化学方面的研究（谢佩松等，2009），而在植物病害的应用和研究较少。由条形柄锈菌小麦专化型（Pucciniastriiformisf.sp.tritici）引起的小麦条锈病（wheatstriperust）和由禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）引起的小麦赤霉病（wheatheadblight）是小麦上的两大重要真菌病害（李振歧，1997）。小麦感染这两种病菌后，不仅产量下降，品质降低，尤其是感染赤霉病菌后，受侵小麦籽粒中含有真菌毒素，可致人畜中毒（程顺和等，2012；杨源等，2012

5、）。本实验利用冷冻切片技术可快速观察到这两种病原真菌在小麦上的侵染情况，为后续的病害发育、鉴定和防治提供科学依据。1　材料与方法1.1供试菌种、品种和接种方法基金项目：中国博士后科学基金  （No. 2015M580882）第一作者：姚娟妮，实验师，主要从事植物与病原菌互作研究。*通讯作者：张国云，高级实验师，从事电子显微镜的研究管理工作。条形柄锈菌接种小麦叶片：供试小麦条锈菌为条中32号生理小种（CYR32），供试小麦品种为水源11（Suwon11），均由西北农林科技大学植物保护学院植物病理研究所提供。水源11的种子播

6、种于直径10cm的培养钵中待小麦长至7–8d，第一叶完全展平，第二叶刚露时进行接种；用毛笔涂抹接种法将新鲜的条锈菌夏孢子接种于小麦叶片；接着将接种植株放置于16℃黑暗保湿箱保湿24h；之后将保湿过的接种植株移至16℃温室培养。接种后第5天采样，随后每隔1天采样一次直至叶片现孢。禾谷镰刀菌接种小麦穗头：供试禾谷镰刀菌（Fusariumgramimearum），供试小麦品种为小偃22（Xiaoyan22），均由西北农林科技大学植物保护学院植物病理研究所提供。收集禾谷镰刀菌野生型菌株PH-1的分生孢子，用无菌水调节孢子浓度至2

7、×105个/ml，接种处于扬花期的小麦（小偃22）穗头的内稃和外稃之间，每粒接种10μl。接种后用保鲜袋喷水保湿，25℃培养，48h摘掉保鲜袋。选取接种点外稃进行冷冻切片。1.2仪器与试剂LEICACM3050S恒温冷冻机，OlympusBX51多功能显微镜，LEICAOCT包埋剂1.3样品的制备与观测取样：将按时间点采集到的样品迅速及时的进行切片。固定样品：将冷刀与切片刀固定在切片机的刀槽上，平放冷台，并启动快速LEICACM3050S恒温冷冻机的冷刀与冷台，将冷刀温度降低到-24℃，冷台温度降至-22℃。将样品切为0

8、.5cm高，随后在冷台底部滴少量LEICAOCT包埋剂，迅速将待切的样品垂直插入包埋剂中，用镊子使其保持竖直状态，待下部完全固定后，在其周围滴加LEICAOCT包埋剂逐层包埋，直至样品全部被包埋并能牢固粘附在样品台上。冷冻切片：把粘附有组织材料的冷台固定于冷台固定槽上，拧紧固定螺钉，将切片厚度设置为20μm，匀速摇动