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1、RRM2在卵巢癌细胞侵袭中的功能研宄陶巍1张蓓通讯作者1.徐州医学院;2.徐州医学院临床学院江苏徐州221000【摘要】目的探讨RRM2在卵巢癌细胞侵袭中的功能.方法siRNA干扰SKOV—3和SKOV-3/cDDP细胞后，比较处理组与对照组间RRM2表达水平，并比较两组细胞侵袭能力.结果:处理组与对照组处理前RRM2表达水平接近，都比较高，处理组在经处理24h、48h后RRM2表达水平明显降低,72h后其水平基木上不变;在经siRNA干扰后,SKOV—3和SKOV—3/cDDP细胞的侵袭能力明显
2、降低.结论:RRM2在卵巢癌细胞中的表达较高并且与其侵袭力呈正相关.【关键词】核糖核苷酸还原酶亚单位M2(RRM2);卵巢癌细胞;侵袭【中图分类号】R711【文献标识码】B【文章编号】1008—6315(2015)12—0079—01RRM2是DNA合成和修复中的限速酶，是细胞凋亡及其重要的调控基因，在妊娠滋养细胞疾病,乳腺癌，小细胞肺癌.宫颈癌,胰腺癌，子宫内膜癌等多种肿瘤中呈过表达,有研宄表明,RRM2的高表达恶性肿瘤的生长以及浸润转移能力呈现正相关[1一2].木文就RRM2在卵巢癌细胞侵袭中
3、的功能进行研究.1主要材料与方法1.1主要材料trizol(takara)Sybrgreen(toyobo)Transwell小室(8um,millipore)Matrigel(BD)DMEM(Hyclone)FBS(Hyclone)双抗(Hyclone)FugeneXtremetransfectionreagent(roche)Primer:β—actin:F—AAAGACCTGTACGCCAACACR—GTCATACTCCTGCTTGCTGAT(扩增片段长度218bp.)RRM2:F
4、-ACCTATGGTGAACGTGTTGTAGR—GGCATCAGTCCTCGTTTCTT(扩增片段长度101bp)RRM2siRNA:sense:UGCUGUUCGGAUAGAACAGd(TT)antisense:CUGUUCUAUCCGAACAGCAd(TT)NC:sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUd(TT)antisense:ACGUGACACGUUCGGAGAAd(TT)1.2方法(1)细胞处理1.1SKOV—3和SKOV—3/cDDP细胞培养在DMEM高糖培养基中，含10
5、%FBS,1%双抗1.2siRNA干粉10D用125ul的DEPC水溶解后，此时siRNA浓度为20uM,分装放至一20冰箱中冻存备用.1.3转染前一天，将SKOV-3细胞消化下来，均匀种至六孔板中，每个孔种2×105个细胞1.4第二天，取92uIDEPCH20+5ulsiRNA+3ul转染试剂至无酶EP管中，混匀后室温静置,20min后均匀加入6孔板一个孔中，摇晃均匀后放入培养箱中培养.培养24h、48h、72h收细胞，检测siRNA干扰效率.(2)RNA提取2.1细胞处理好后，去除
6、培养基，往六孔板中加PBS洗一遍细胞，去除PBS,加入1mltrizol,室温放置2min,将trizol转移至无RNA酶的EP管中.2.2加入氯仿200U
7、,用力振摇15s,室温静置15min,离心(4°C,12,000g,15min).2.3离心后液体分为三层，小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中.2.4加入等体积异丙醇,上下颠倒混匀，室温静置5min,离心(4°C,12,00Og,10min).2.5去上清，沉淀加入75%乙醇1ml,轻微振荡15s,离心(4°C,7,50Og,5min)2
8、.6小心去上清,管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3—5min.最好是用枪头吸取上清，尽量除去.2.7加入50μIDEPC水溶解,nanodrop检测浓度厂80°C冰箱保存.2.8逆转录2(.9荧光定量PCR3＞细胞侵袭实验3.1消化SKOV—3和SKOV-3/cDDP细胞,在六孔板中每个孔种2×105个细胞，培养第二天转染NC和siRNA,培养24h.3.2Transwell小室制备:用50mg/LMatrigel1:5稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,37°C培养箱
9、中放置1小时凝固.3.3制备细胞悬液:制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12h,进一步去除血清的影响.消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1一2遍,用无血清培养基重悬.3.4接种细胞:上室接种无血清细胞悬液，每孔接种量为50000个，下室加入含血清培养基.常规培养24h.3.5培养24h后，去除transwell小室中的培养基，用棉签去除小室中残留的细胞，加入结晶紫染色10min,用PBS清洗后，在显微镜下拍照.2结果2.1RRM2siRNA干扰效果检测处理组与对照组处理
