稳定表达egfr

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1、稳定表达EGFR赵晓蓉，曹利民，彭吉林，王敏，赵晓平，吴砂，李文涵，叶庆，沈关心[摘要]目的：建立稳定表达EGFRGFP融合蛋白的细胞系。方法：CaCl2法将pEGFREGFP质粒转化DH5α，酶切鉴定后提取质粒经电穿孔转染CHOK1细胞；以EGFP作为荧光报告分子，克隆化培养以获取单克隆阳性细胞；流式细胞术、荧光显微镜术、Jovin教授惠赠。　　1.1.3主要试剂：限制性内切酶NheⅠ、KpnⅠ（FermentasMBI公司），PE标记的antiEGFR抗体（BDPharmigen公司），G418和RPMI1640培养基（GibcoBRL公司），兔anti

2、EGFR（SantaCruz公司），碱性磷酸酶（AP）标记的antirabbitIgG（Sigma公司）。　　1.2实验方法　　1.2.1pEGFREGFP质粒转化大肠杆菌及鉴定：采用CaCl2法将pEGFREGFP质粒转化DH5α大肠杆菌，挑选卡那霉素抗性菌落碱变性法小量抽提质粒后用限制性内切酶NheⅠ、KpnⅠ双酶切鉴定，对正确的克隆进行扩增培养，大量抽提高纯度质粒用于转染CHOK1细胞。　　1.2.2pEGFREGFP载体转染CHOK1细胞及筛选：采用电穿孔转染法（Eppendorf电穿孔转染仪）将pEGFREGFP质粒转染CHOK1细胞（电压290V

3、、时间40μs）。转染后48h加入G418工作液，终浓度800μg/ml，每3～5天换培养液。培养14d后，将细胞有限稀释并克隆化培养于96孔培养板中。培养5d后，挑选单克隆细胞生长孔于倒置相差荧光显微镜下观察，发绿色荧光的细胞为阳性细胞，待孔中细胞约铺满半孔时，传代于25ml培养瓶中扩大培养。　　1.2.3EGFRGFP融和蛋白表达检测:①流式细胞仪（FCM）检测：细胞用胰酶消化，PBS洗一次，按每106个细胞10μl的比例加入PE标记的antihumanEGFR，室温孵育30min，PBS洗两次用流式细胞仪（FACSCalibur,BD公司）检测。②倒置

4、相差荧光显微镜观察：细胞培养于96孔板，PBS洗一次，按上述比例加入PE标记的antihumanEGFR，室温孵育30min，PBS洗5次，倒置相差荧光显微镜（Axiovert40，Zeiss公司）GFP、PE双通道观察细胞中EGFRGFP融和蛋白的表达，定位并照相。③免疫印迹（NaCl,50mMTrispH72,5mMEDTA,1%tritonX100,0.1%SDS,1mMPMSF）0.2ml，室温抽提蛋白质15min，10000rpm离心15min，取上清，加入上样缓冲液煮沸3min，10％SDSPAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜，用含5%milk的

5、0.2％Tin，加入AP标记的antirabbitIgG37℃孵育1h，TBST洗涤30min，加入AP底物显色。④EGFRGFP融合蛋白表达稳定性的检测：将所获单克隆阳性细胞反复液氮罐中冻存、复苏10次，每次传代培养4次以上，流式细胞仪检测其EGFRGFP融合蛋白表达。　　1.2.4细胞生长曲线的绘制：将CHOK1细胞及所获单克隆阳性细胞按1.25×104/孔接种于24孔细胞培养板，转染细胞中加入G418400μg/ml，每24小时每组取3孔细胞记数，计算均值，连续6d，绘制细胞生长曲线。　　1.3统计分析利用SAS软件采用配对t检验对数据进行统计学分析。

6、(责任编辑：admin)　　2结果　　2.1pEGFREGFP质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳结果　　本研究所采用pEGFREGFP质粒为将人EGFRcDNA通过NheⅠ、KpnⅠ双酶切位点插入到pEGFPN3载体上。如图1所示，NheⅠ单酶切可见8.3kb片断，NheⅠ、KpnⅠ双酶切可见4.7kb和3.6kb两片断，与文献报道一致[2]，表明质粒转化成功。　　2.2稳定表达　　EGFREGFP融合蛋白细胞系的建立经克隆化培养，获得1株胞膜呈绿色荧光的单克隆细胞，命名为CHOEGFRGFP1，其细胞形态与CHOK1无明显差别。经流式细胞仪检测，未转染的CHOK1

7、细胞GFP、PE双标记均为阴性，CHOEGFRGFP1细胞GFP、PE双标记阳性率达92%以上，说明EGFRGFP融合蛋白主要表达于细胞膜上（见图2）。倒置相差荧光显微镜观察可见CHOEGFREGFP1主要表现为细胞膜绿色荧光，能与PE标记的antihumanEGFR结合（见图3），与流式细胞仪检测结果一致。.parisonoffixationprotocolsforadherentculturedcellsappliedtoaGFPfusionproteinoftheepidermalgroetry,1999,35(4):353-362.　　[3]Pere

8、z-SolerR.HER1/EGFRtargetin