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1、黄芩素处理后MMP 人乳头状瘤病毒感染是宫颈癌的主要致病因素,其中受其编码的癌蛋白为E6,它参与了细胞外信号调节激酶1/2(extracellularsignal-regulatedkinase1/2,ERK1/2)信号通路的转导并加剧了正常宫颈上皮的癌变[1].Oishee等[2]研究发现,E6蛋白通过Rap1(Ras-proximate-1orRas-relatedprotein1)使丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)信号通路激活.同时大
2、量研究表明,基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase2,MMP-2)、MMP-9与恶性肿瘤的浸润、转移和发展相关,抑制MMP-2、MMP-9的表达是控制癌细胞侵袭和转移及预后的关键[3].黄芩素是中药黄芩的主要成分,具有抗炎、抗氧化、免疫调节以及抑制肿瘤等作用[4],黄芩水提物可以明显抑制宫颈癌HeLa细胞的体外生长,与药物的作用时间和浓度成正向关系[5].本研究通过前期实验确定黄芩素处理的时间,用不同浓度的黄芩素处理HeLa细胞,探索MMP-2、MMP-9活性变化和ERK1/
3、2表达变化及可能的机制,力图阐明黄芩素处理后MMP-2、MMP-9活性与ERK1/2信号通路之间的相互关联,为研究宫颈癌的发生、发展提供实验依据. 1材料和方法 1.1材料HeLa细胞株由泸州医学院附属医院医学实验中心惠赠,DMEM高糖培养基购于HyClone公司,黄芩素购于ChengduMustBio-Techology公司,其余PAGE胶成分购于上海生工公司,明胶粉剂购于Sigma公司,小鼠抗β-actin抗体及5上样缓冲液购于碧云天公司,蛋白酶抑制剂购于Roche公司,兔抗人MMP
4、-2抗体、兔抗人MMP-9抗体、兔抗人ERK1/2抗体及兔抗人磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)抗体均购于CST公司,反转录PCR试剂盒购于天根公司.ERK1/2、MMP-2、MMP-9引物均由上海生工合成. 1.2方法 1.2.1细胞培养用含有100mL/L灭活胎牛血清及100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基培养HeLa细胞.置于37℃、50mL/LCO2细胞孵箱常规培养. 1.2.2细胞分组对数生长期细胞,经2.5g/L胰酶消化后接种(接种1.5106个
5、/皿)到10cm直径的一次性培养皿中,使用含100mL/L胎牛血清的DMEM高糖培养基培养细胞,等待细胞贴壁,生长24h.换无血清DMEM高糖培养基同步化处理24h后,用含有(0、100、200、300)μmol/L黄芩素的无血清DMEM高糖培养基培养12、24、48h.镜下观察,与空白对照组相比较,3个浓度组在12h时,细胞形态和数量变化不大;24h时,300μmol/L黄芩素处理组及48h时各浓度处理组,细胞大量凋亡(凋亡率约80%~90%),无实验意义,最终选择处理24h,空白对照组
6、、100μmol/L黄芩素处理组及200μmol/L黄芩素处理组.每组设3个复孔.分为空白对照组:不含黄芩素的无血清DMEM高糖培养基培养细胞;100μmol/L黄芩素处理组的黄芩素终浓度为100μmol/L;200μmol/L黄芩素处理组的黄芩素终浓度为200μmol/L. 1.2.3明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9的活性变化黄芩素处理24h后,在相同条件下培养并同步化细胞后,空白对照组加入无血清DMEM高糖培养基,100μmol/L黄芩素处理组加入含
7、有黄芩素终浓度为100μmol/L的DMEM高糖培养基,200μmol/L黄芩素处理组加入含有黄芩素终浓度为200μmol/L的DMEM高糖培养基.各组均刺激24h后,收集上清,分装后置于-80℃保存.每组取15μL上清与5μL上样缓冲液均匀混合,放置于室温10min后,电泳;电泳结束后把胶放入含TritonX-100的复性液中复性40min,然后轻柔漂洗胶40min,放入孵育液中,37℃过夜.次日,考马斯亮蓝染色1h后,脱色30min.放入成像仪中成像后用Quantit
8、yOne软件半定量分析图片.通过吸光度(A)值反应各组金属基质蛋白酶活性的变化. 1.2.4反转录PCR法检测ERK1/2、MMP-2和MMP-9mRNA的表达按照反转录PCR试剂盒上操作步骤进行PCR实验.ERK1/2序列为F:5'-GATTGCCGATCCTGAGCATGAC-3',R:5'-GCAGGTCAAGGGCCAGAATG-3';MMP-9序列为F:5'-TT-CAGGAGACGCCCATTTC-3
