结核亚单位疫苗免疫方案和il-7、il-15对t细胞免疫记忆的影响

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1、分类号：Q3密级：公开研究生学位论文结核亚单位疫苗免疫方案和IL-7、IL-15对T论文题目（中文）细胞免疫记忆的影响TheresearchonTcellimmunememoryinducedbydifferentvaccinationschedulesof论文题目（外文）Mycobacteriumtuberculosissubunitvaccine,andcoadministrationofIL-7andIL-15研究生姓名白春香学科、专业生物学·遗传学研究方向基因工程与分子免疫学学位级别博士导师姓名、职称祝秉东教授论文工

2、作起止年月2015年9月至2018年3月论文提交日期2018年4月论文答辩日期2018年6月学位授予日期2018年6月校址：甘肃省兰州市第一部分结核亚单位疫苗免疫方案和IL-7、IL-15对T细胞免疫记忆的影响中文摘要结核病（tuberculosis）是主要由结核分枝杆菌感染（Mycobacteriumtuberculosis）引起的一种慢性传染性疾病。其病死率在传染性疾病中已经居于第一位，是全世界的第九大死因。预防和控制传染病的最佳方式就是有效疫苗的接种，结核病难于控制的主要原因是缺乏有效的结核病疫苗。目前唯一临床批准的预

3、防结核病的疫苗是牛分枝杆菌减毒活疫苗卡介苗（BacilleCalmette-Guérin，BCG）。它能够有效地控制儿童严重结核病的发生，但是，它的保护性免疫应答随着年龄的增加逐渐减弱，对成人肺结核保护效果不确定。研究报道，主要是因为BCG的持续刺激，诱导更多的寿命较短的效应记忆性T细胞（effectormemoryTcells，TEM）和效应T细胞（effectorTcells，Teff）产生，而提供长效免疫保护效果的中央记忆性T细胞（centralmemoryTcells，TCM）较少所致。因此，研发新的结核疫苗和有效的

4、免疫策略来提高TCM的数量，增强长效的保护效果是目前的当务之急。蛋白亚单位疫苗是一种新型的结核疫苗，可以诱导足够多的TCM提供抗结核的长期保护效果。亚单位疫苗通常需要多次加强免疫才能取得有效的免疫保护。研究认为加强的时间间隔可以决定T细胞的类型，影响机体抗感染的免疫记忆应答。因此优化亚单位疫苗免疫接种间隔对于诱导长效的免疫记忆具有重要意义。结核亚单位疫苗常规免疫方案是免疫3次，每次间隔2-3周。目前尚缺乏对结核亚单位疫苗免疫接种方案对T细胞免疫记忆的系统研究。同时，亚单位疫苗需要佐剂的辅助来诱导较强的免疫应答，合适的佐剂能提

5、高免疫应答的水平。目前临床上使用的佐剂很少，它们主要促进体液免疫应答。因此，研发可诱导细胞免疫应答的佐剂对于结核疫苗的开发至关重要。一些研究表明：IL-7和IL-15对于记忆T细胞的发育和维持至关重要。因此本研究我们选用了实验室前期构建的结核亚单位疫苗ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c（简称LT70）和Mtb10.4-HspX（简称MH），它们在小鼠实验中均展现出了较强的免疫保护效果。我们应用LT70和MH，研究结核亚单位疫苗免疫方案和IL-7、IL-15对T细胞免疫记忆的影响。目

6、的：基于上述研究背景，本研究应用结核亚单位疫苗进行下列研究：1、通过设计结核亚单位疫苗不同的免疫间隔时间，研究疫苗免疫间隔时间对T细胞免疫记忆的影响。I2、此外，应用细胞因子IL-7和IL-15作为结核亚单位疫苗的佐剂，以提高结核亚单位疫苗诱导的免疫记忆和更持久的保护效果。方法：1、制备亚单位疫苗LT70，按照下列方案免疫小鼠：①0、3周和6周(0-3-6w)，②0、4周和12周（0-4-12w）和③0、4周和24周（0-4-24w）；PBS5和BCG（5×10CFU）组作为对照组。各个免疫组末次免疫时间一致。2、应用腺病毒

7、包装系统AdMax构建和包装重组腺病毒rAd-IL-7、rAd-IL-15、rAd-IL-7-IL-15和rAd-IL-7-IL-15(Linker)；选用结核亚单位疫苗LT70和MH联合重组腺病毒rAd-IL-7、rAd-IL-15、rAd-IL-7-IL-15和rAd-IL-7-IL-15(Linker)，分别在第0、2、4周免疫小鼠。3、通过ELISA法检测Ag85B特异性抗体IgG1的水平；通过ELISA法检++测脾脏淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ的水平；通过胞内染色法检测CD4和CD8T细胞分泌IFN-γ、IL-

8、2和TNF-α的水平；通过延长ELISPOT检测中央记忆样T++细胞的数量；利用两次抗原刺激，胞内染色法检测CD4T细胞和CD8T细胞分++泌IFN-γ的能力，反映CD4和CD8中央记忆样T细胞的数量；通过EdU法检++测CD4和CD8记忆T细胞的增殖水平；通过TB10.4pentamer