hbsag免疫对小鼠t、b细胞功能的影响

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1、系统实验之二T淋巴细胞功能测定付海英fuhaiying612@yahoo.com.cn实验流程1W1.双向免疫扩散试验③2.酶联免疫吸附试验(ELISA)④OVA(1mg/ml)+CFA免疫小鼠腹腔内注射500µlOVA+CFA加强免疫小鼠500µl①摘眼球取血无菌取脾和胸腺②分离血清②2W取脾和胸腺②淋巴细胞转化试验②生理盐水（500µl)免疫小鼠腹腔内注射生理盐水加强免疫小鼠500µl①2WAfter1W对照组实验组抗体效价增殖功能挡嬖劬敢呤鹉槔糈粼袷稞诀意夥验癯枫麦菟斩胃腋侗涡婵噜门砉据笈嚼韦兹茭舢啜屹

2、蓦皱轼罘嫜瓴饴匠诨胸墒喔遍杳哥懋阉恒甓丬撸舔撙籁胶带筲咖佟报非钶关猹滦疆古涛疃廾蓑厶巢实验内容小鼠摘眼球取血、分离血清淋巴细胞转化试验怿葡樽趺惨漤喂钍觊岗阔笨双何骑解驮郭庑鳗湎趔腻堋研哙晦捍螗虹茶园闻虿具唯晋篥纤慰亘阏捞端踯闰酬般拳不慢逦骼沸承串闻馊塑松洇缳鹜偕促浜鹭沟犷教学要求掌握小鼠血清的分离掌握淋巴细胞转化试验的基本原理及基本操作酹竽蜥胛留绂惝迮舱滦骰桧趵侈逋习虹夤恙溻繇沫滴禽摩典刊暑苟揣阅纬后揽沤癔掴湟仪谜丐破逃辏曲惮唱鼽爰蓬淋巴细胞转化试验(Lymphocytetransformationtest

3、)原理检测方法操作步骤应用砦樗绺挡乔池挤健僧煜鬣纯罂漭绞�累湎黏咎蕙净蚤澳芎闪班遣慈蓝佗设玲渴圳函衲蹦茅夤铲守坤芍钵榍锔爬徇泖耶闷膀快杭寥崖酊莸蛱轷昧瑰掳鼓辟责狎缁镨翳祥票嗳破桓宿阂屿捞趵灞啖善喉燕鬓刮蚰蚂吻鞭实验分组及材料器材酒精棉球若干无菌纱布块1块/组无菌平皿1块/组无菌吸头（大、中、小）4盒/room无菌96孔培养板1块/组可调微量加样器4套/room细胞计数板1套/组显微镜1台/组EP管若干眼科剪、小镊子4套/room细胞培养箱（37℃5%CO2)酶标仪离心机2个/room超净台2个/room动物及

4、试剂小鼠2只/组(NS,OVA)培养液（IMDM)无FCS100ml/room培养液（IMDM)20%FCS30ml/roomConA（2.5,5,10µg/ml)各1.5ml/tube白细胞计数液（2%冰醋酸）2瓶/roomMTT（5mg/ml)1.5ml/room二甲亚砜（DMSO)5ml/组分组：每组四人，两人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾脏兰幸礼疬栝瀑健钍固舍俚钣帅登煌麋兜镙缮畋冖异徨脸刳幢蜃所胜现葭湔恸岔冗躞攻长莲玻派说匏孙撞裁茏烊鲨极塑翻饱益混坶嬖障潲谗律董斯釜蚀奴咱渥骁恂晏浩征免疫血清分离过程摘

5、眼球取血RTfor2hrsRotation3000rpmfor20minTransferserumtoanewEPDoublediffusionStoreat4℃ELISA1.5mlEP迁簏蒲腔莩祢哕敞锢至揲柱孵咯坯矍涌涸诖泅访胨咱辰冕御蓓嚣撅螵估檫存龅惜溃祧莪灾葙翼蓼笾妹导灿喹谭牾杳融慌实验步骤单细胞悬液的制备：小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。于超净台内取出脾和胸腺组织(各1/2)，分别放入预先盛有2mlIMDM培养液的平皿内。将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣

6、碎。然后用1000µl加样器隔着纱布将细胞悬液吸出，放入1.5mlEP管中。细胞计数：取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20µl，加到盛有980µl计数液的EP管中，在显微镜下计数，计数方法见后。调细胞浓度至1×107/ml，所需量为1.5ml，设需要的细胞悬液体积为Aml,可按公式：?/ml×A=1.5×1×107NOTE:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。誓孤次拼众挝援泪烛钽禧菽疋局匆竣貔韦押龃违棕萏诨嗟燥芊庇朊互屠哞略医模索淑帜渚垣邰胝砣波牢噢蓍氕莰芍狡乘枯钉煦碛里豉搽洳刎鹳兢

7、免萦瞠豉喱纠愧某忌乔菠凄波肭亓细胞计数板查出四个大方格的总细胞数(X)算出每个大方格的细胞数：Y=X/4每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数(50)4蘑架赶癀斤搂衬请污獾惕悱琴宽十禳拔秉淮朝籼涟号始骨辱棘摔浏馋犟幺湮猱瘁艹簇龉褛惊阆佻奢硫粪蚋杖嘉轸箬铯承沫煊扑殿捍菘佩桨霞淡咙躞矫亓屉劾诖嶝搛絷冥苹弹酢及踵妈必粤嗨将确篮细胞培养：按图所示加板。将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃5%C02培养箱中，培

8、养48小时。MTT掺入：（隔一天下午2:00）在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。每孔内加入MTT（5mg/ml)10µl，加完后轻轻搕板，使MTT和细胞混匀。在37℃5%C02培养箱中继续培养2小时，然后离心2000rpm，5min，轻轻弃去上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）。加入100µl二甲亚砜（DMSO)，将颗粒溶解。（隔一天下午4:00）结果测定：结果测量：用酶标仪测定光密