muc1基因疫苗和gmcsf对小鼠的细胞免疫和体液免疫应答

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1、MUC1基因疫苗和GMCSF对小鼠的细胞免疫和体液免疫应答【摘要】目的：观察MUC1基因疫苗和GMCSF共免疫对小鼠特异性细胞免疫和抗体水平的影响.方法：采用股四头肌肌肉注射，将构建的MUC1基因疫苗pcDNA3.1MUC1免疫雌性Balb/c小鼠，每3orphicepithelialmucin)，MUC1基因的一个重要特征是其多态性［1］,即其第2个外显子中含有许多连续重复序列(variablenumberoftandemrepeats,VNTRs)，抗原表位即位于VNTRs区.此种肽链表位在正常表达时被MUC1外周糖链所掩盖，不能

2、被识别.在癌变细胞表面，由于糖基化不全抗原表位才得以暴露,成为肿瘤主动特异性免疫治疗的理想靶分子.粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）是目前研究最多的细胞因子之一，其主要通过增强树突状细胞（DC）对抗原的加工和递呈而成为一种有效的免疫调节剂［2］.但MUC1基因疫苗和GMCSF共免疫对小鼠特异性细胞免疫CD4+/CD8+T淋巴细胞水平的影响尚少见报道.我们探讨了MUC1基因疫苗和GMCSF共免疫对小鼠特异性细胞免疫及体液免疫应答的影响.　　1材料和方法　　1.1材料　　小鼠乳腺癌细胞系EMT6为本室保存.雌性Balb/c小鼠3

3、0只，4～6repeats的MUC1质粒pVaxMUC1由英国ImperialCancerResearchFund的TaylorPapadimitriou教授惠赠.E.coliDH5α由本室保存.　E.Z.N.ARplasmidMiniprepkit（Omega公司）；DMEM（Gibco公司）；RPMI1640培养液（Sigma公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；抗MUC1mAb（AntibodyDiagnostica公司）；FITC标记的抗小鼠Leu3(CD4)mAb，PE标记的Leu2(CD8)mAb，FITC

4、标记的抗鼠IgG1，PE标记的抗鼠IgG1（Gibco公司）；流式细胞仪（美国BectonDickon公司）；淋巴细胞分离液（上海试剂二厂）；链霉素卵白素生物素过氧化物酶复合物(SABC)试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）.　　1.2方法　　1.2.1pcDNA3.1(+)MUC1构建及表达［3］提取质粒pVaxMUC1及pGEM3zf(-)载体,分别经HindⅢ,XhoⅠ及HindⅢ，SalⅠ双酶切(SalⅠ与XhoⅠ互补)，回收MUC1DNA片段及pGEM3zf(-)，连接，转化感受态细

5、胞DH5α，挑取单克隆，提取质粒，双酶切鉴定.DNA测序正确后将双酶切回收的MUC1目的基因与预先经HindⅢ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3.1(+)载体进行连接反应.以连接反应液转化感受态DH5α，提取质粒,进行酶切鉴定.电穿孔法转染COS7细胞.间接免疫荧光检测表明MUC1在COS7细胞表达.　　1.2.2质粒提取及纯化以碱裂解法大量制备重组质粒pcDNA3.1MUC1及空载体pcDNA3.1，采用聚乙二醇（PEG）沉淀法纯化.以无菌生理盐水溶解质粒，通过紫外分光光度计测定A260nm及A280nm值计算浓度.A260nm/A2

6、80nm达1.8～2.0时，定量，用无菌生理盐水稀释成浓度为1g/L,-20℃保存.　　1.2.3EMT6乳癌细胞中MUC1表达的免疫组化染色检测取少许EMT6小鼠乳腺癌细胞（密度以形成单细胞层为宜），分别滴于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，经空气干燥后，于-20℃用冷丙酮固定5min，经蒸馏水洗，空气中干燥后，4℃保存.用ABC免疫组化法染色，一抗为羊抗小鼠MUC1mAb，二抗为兔抗羊多克隆抗体，工作浓度为1∶100，DAB显色，脱水，封片待检.对照组用PBS代替一抗作为空白对照.如细胞质和细胞核染呈棕褐色者判为阳性细胞.　　1.2.4基因

7、免疫将30只小鼠随机分为pcDNA3.1MUC1加GMCSF组（MUC1+GMCSF组）、MUC1基因疫苗组（MUC1组）和空载体pcDNA3.1对照组（pcD3.1组），每组10只.将每只小鼠接种1g/L质粒100μL，肌肉注射于小鼠股四头肌肌肉丰厚处，间隔3g/LGMCSF100μL.于1次基因免疫后第3周，在小鼠右侧胸前皮下接种密度为1×1013/L的MUC1阳性表达的EMT6细胞0.2mL［4］.　　1.2.5肿瘤生长情况的观察接种小鼠乳腺癌细胞EMT6后，每周观察、记录1次肿瘤的生长情况.　　1.2.6T淋巴细胞亚群分析

8、用流式细胞仪检测淋巴细胞表型，采用直接免疫荧光法，所用荧光mAb：①对照组，小鼠IgG1.②Leu3(CD4)，Leu2(CD8)，均为小鼠IgG1(CoulterClone).每组准备1