姜黄素抑制子宫内膜异位症雌激素生成的实验研究.doc

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1、姜黄素抑制子宫内膜异位症雌激素生成的实验研究作者：余峥，王文娟，张昌军，彭海英【摘要】目的观察姜黄素对子宫内膜异位症内膜细胞雌激素生成水平的影响。方法首先建立子宫内膜异位症体外模型，分离培养EMs腺上皮细胞和间质细胞，随后将分离培养的细胞与混合培养细胞的雌激素分泌水平进行比较，明确EMs内膜高水平雌激素的组织来源，再次混合培养EMs的异位内膜细胞，加入终浓度为50ug/ml的姜黄素，进行药物干预。分为非EMs内膜细胞组、EMs内膜细胞组、姜黄素组及来曲唑组，电化学发光免疫法检测培养液上清中雌二醇水平。结果电化学发光免疫法表明，EMs内膜细胞组雌二醇分泌水

2、平最高，为（土）pg/ml,明显高于其余各组，组间比较差异有极显著性。EMs内膜细胞分泌雌二醇的水平随着时间的延长而增加。姜黄素50ug/ml组和yg/ml来曲哇组较未给药的EMs内膜细胞组分泌雌二醇的水平明显降低。结论EMs内膜细胞分泌雌激素呈高表达，并且间质细胞和腺上皮细胞均有较强的分泌能力，与非EMs内膜细胞相比，差异显著。姜黄素可抑制EMs体外雌激素分泌的能力，并呈时间依赖性。【关键词】子宫内膜异位症；姜黄素；雌激素子宫内膜异位症是生育期妇女常见的良性疾病，不孕率呈逐年上升趋势，其发病机制尚未阐明。在经血逆流“种植学”的基础上，研究学者提出的“在

3、位内膜学说”表明，EMs的在位和异位内膜相似的具有与正常子宫内膜迥异的遗传和内在生物学特性。因此可以推测，EMs在位内膜是病变的源头，而直接干预在位内膜可达到防治EMs的效果。EMs是雌激素依赖性疾病，雌激素的合成和代谢与EMs的发生发展密切相关。抑制EMs病灶局部雌激素生成成为目前研究关注的热点。姜黄素是从姜黄、郁金的块茎中提取的一种植物多酚，具有抗炎、抗肿瘤、诱导凋亡等作用。近年研究表明它在体内外均可诱导EMs内膜细胞凋亡。本实验以EMs异位细胞体外模型作为实验对象，以“雌激素依赖性疾病”为切入点，观察姜黄素对其雌激素生成是否具有抑制作用，探讨姜黄素

4、源头治疗EMs的作用靶点和机制，为EMs的治疗开辟新的途径。1材料试剂的配制DMEM液称量DMEM粉剂g放入烧杯中，用少量的三蒸水混匀，再用三蒸水定容至400ml,用增压滤器高压除菌，装入消毒瓶中备用，4°C保存，用前加入10%含量的胎牛血清。4%台盼蓝母液称取4g台盼蓝置于研钵中，加入少量的三蒸水反复研磨，再加入三蒸水至100ml，以1500r/min离心15min,收取上清液即为4%水溶液，使用时用PBS稀释至％。%胰酶称量PBS粉剂g，胰酶，g，将其放入100ml三蒸水中混匀，用增压滤器高压灭菌，放入消毒瓶中备用。%EDTA称取gNa2EDTA•2

5、H20,置于1L烧杯中，加入约800ml的去离子水，充分搅拌，用NaOH调节pH值至，目测标本体积。加入lml胎牛血清，保持标本的湿润。取出小号组织皿，将血清以点状滴入小号组织皿中，轻轻的晃动，使血清均匀的铺满皿底。用无菌吸管吸取组织，分别置于小号组织皿中，将组织均匀的铺满皿底，用无菌吸管弃去多余的血清，用记号笔标记组织皿。将小号组织皿置于37°C含5%C02培养箱中孵育4h，倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，可见间质细胞已经贴壁生长未见腺上皮细胞贴壁。用含20%胎牛血清的DMEM液缓慢的滴入小号组织皿中，每皿加入2ml。再次放入37°C含5%C02的培养箱

6、中培养，倒置显微镜下观察，EMs组和非EMs组内膜形态相似。24h后间质细胞已经完全贴壁，形态较扁平，呈梭形或纺锤形，外形轮廓不太清晰，核不明显，培养34d后细胞与细胞之间呈平行排列；腺上皮细胞培养24h后可见大部分贴壁，呈蝌蚪形或多角形，漩涡状成团排列，并逐渐向外生长，核仁较大而明显，细胞间出现丝状连接。每2〜3d更换1次培养液，镜下观察细胞生长情况。细胞传代培养用倒置显微镜观察，当细胞铺满90%培养皿时即可传代。用无菌吸管弃去组织皿中的培养液，加入已预温好的PBS液2ml进行洗涤，用无菌吸管弃去洗涤液。加入含%EDTA的胰酶2ml，放入培养箱中消化4

7、〜6min，期间取出镜下观察细胞消化情况，细胞呈现椭圆形，细胞与细胞间的连接中断，此时，表明消化已完全。加入含10%胎牛血清的DMEM液终止消化。并用巴氏管将细胞从皿底吹打下。用无菌吸管将细胞及培养基一并取出置于离心管内，配平，放入离心机内，900r/min,离心5min。弃去上清液，再次加入含10%胎牛血清的DMEM液5m1重悬，充分吹打，使细胞均匀的分布于培养液中。将离心管内的细胞悬液分装置2个中号组织皿中，镜下观察细胞密度。以密度60%为佳。密度过高或过低均不利于细胞的生长。细胞观察与鉴定活细胞观察每天用倒置显微镜直接观察贴壁的活细胞生长情况。细胞

8、免疫荧光鉴定将原代培养的EMs细胞消化并计数，按照lX104/ml将其接种于24