过度表达g蛋白调节子16促进大鼠胶质瘤c6细胞增殖

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1、过度表达G蛋白调节子16促进大鼠胶质瘤C6细胞增殖摘要:目的探讨G蛋白调节子16（RGS16）对大鼠胶质瘤C6细胞的生物学特性的影响.方法利用脂质体介导法将RGS16基因导入C6细胞中，在倒置显微镜下观察细胞形态变化和贴壁情况;3H-TdR法检测C6细胞在转染不同梯度pCMV5-RGS16和pCMV5质粒后的增殖情况;免疫细胞化学法检测转染前后RGS16蛋白的表达情况;流式细胞仪检测转染pCMV5-RGS16和pCMV5质粒36h后细胞周期变化和细胞是否有凋亡发生.结果转染pCMV5-RGS16质粒24h后30%细胞贴壁性降低，突起

2、收缩，细胞变圆;RGS16蛋白表达阳性;3H-TdR法检测显示C6细胞增殖速度与转染pCMV5-RGS16的量呈正相关;细胞周期结果显示G1期细胞百分数减少10%，而S期细胞百分数增多14%;未发现RGS16与凋亡有直接关系.结论RGS16可能促进C6细胞的增殖.　　KeyaC6cells.METHODSpCMV5-RGS16orphologicalandadhesivechangesofthecellsicroscope.ProliferationofC6cellseasuredby3H-thymidine（3H-TdR）assa

3、yaftergradi-enttransfectionsofpCMV5-RGS16andpCMV5.ExpressionofRGS16inedbyimmunocytochemicalmethodbothbeforeandafterthetransfection.Floetryeasurechangesinthefractionnumberofthecellcyclephaseandtodetectately30%ofC6cellsgreetryshoberofG1phaseofC6cellsreducedby10%andthatof

4、Sphaseaccu-mulatedby14%andRGS16couldnotinduceapoptosisofC6cells.CONCLUSIONRGS16mightpromotetheprolifera-tionofC6cells.　　0引言　　G蛋白在丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-acti-vatedproteinkinases，MAPK）引起细胞增殖和分化的信号转导过程中起重要调控作用［1］.G蛋白调节子（regulatorsofGproteinsignaling，RGS）是近年来新发现的参与G蛋白信号转导的一个大家族

5、，主要功能是负调节Gαi和Gαq亚基，其成员超过20种［2］.1997年我们［3］在小鼠垂体内克隆了RGS16，并发现其在肝、垂体和脑组织内表达丰富.最近发现RGS16可能参与细胞的应激反应［4-7］.根据文献检索RGS16在胶质瘤中的作用尚未见报道，因此，我们将外源性基因RGS16导入C6细胞，观察其对细胞的影响，为确定RGS16蛋白的功能和其在C6细胞信号转导中的作用提供依据.　　1材料和方法　　1.1材料大鼠胶质瘤细胞C6:本室保存;pCMV5-RGS16，pCMV5和RGS16抗体:新加坡国立大学林圣彩教授惠赠;脂质体:Gi

6、bco公司;3H-TdR:上海原子能研究所;免疫组化试剂盒:武汉博士德公司;DNA-Prep试剂盒:美国Coulter公司.　　1.2方法　　1.2.1基因转染［8］C6细胞在含150mL・L-1小牛血清的RPMI1640培养液中常规培养，细胞生长至对数期时以1×105/孔接种于6孔培养板.将pCMV5-RGS163μg和脂质体10μL分别溶于无血清培养液100μL，两溶液缓慢混匀，室温放置30min，加入无血清培养液0.8mL，混匀后加入上述6孔培养板中，常规培养4h后，每孔加入含150mL・L-1小牛

7、血清的RPMI1640培养液2mL.同样方法转染pCMV5作为对照.只加脂质体每孔10μL和未处理组各3孔作为阴性对照.阳性率计算:在随机一显微镜视野下，阳性率=RGS16蛋白表达阳性的细胞数×100%/总细胞数.转染24h后分别在倒置显微镜下观察细胞的形态变化.　　1.2.23H-TdR掺入法［9］取对数生长期细胞，消化后制成1×109・L-1细胞悬液，按每孔100μL接种于96孔培养板，培养4h，细胞贴壁.将pCMV5-RGS16和pCMV5质粒分别按4组不同梯度（90，180，270，360ng/孔），与0.8μ

8、L脂质体分别溶于25μL无血清培养液，每个梯度3孔，两溶液缓慢混匀，室温放置30min，混匀后加入上述已接种细胞的96孔培养板中，24h后每孔加3H-TdR1.85×104Bq（50μL），继续培养12h，吸取上清液，PBS洗涤3次后