靶向traf6抗肿瘤药物的筛选及其机制探究

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1、靶向TRAF6抗肿瘤药物的筛选及其机制探究TRAF6targetedanti-tumordrugscreeningandmechanismstudy专业学位类别：药学作者姓名：李妙指导教师：周立军副教授天津大学药物科学与技术学院二零一七年五月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日

2、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日摘要肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor6，TRAF6）属于肿瘤坏死因子相关因子家族（TRAF1-7），该蛋白在许多肿瘤组织中都存在过度表达与与

3、异常激活的现象，还参与调控了肿瘤细胞的恶性生物学行为，这些证据表明在肿瘤的发生发展过程中TRAF6与其具有密切关系。利用计算机辅助药物设计我们找到了能够与之功能结构域（RING环指结构域与第一个锌指结构域）结合的化合物，从而阻断了TRAF6与E2结合酶Ubc13的结合，使其不能有效激活下游信号通路。之后我们利用MTT实验发现该化合物能够有效抑制癌细胞的增殖，并具有较低的半数抑制率（IC50=10M），之后的流式实验表明：增殖抑制现象的产生可能是由于该化合物的刺激促使宫颈癌细胞HeLa细胞系发生了早期凋亡。而且与细胞程序性凋亡相关的蛋白在表达水平上也发生了改变：与细胞凋亡相关的

4、蛋白Bax的表达量相对升高，与抗细胞凋亡相关的蛋白Bcl-2的表达量相对降低。之后的机理研究表明，该化合物能够抑制TRAF6下游靶点AKT的泛素化与磷酸化，而且能够抑制另一靶点TAK1的磷酸化。这一结果也间接证明了该化合物是与TRAF6发生了结合并阻碍其发挥泛素连接酶的功能。因为N6-Isopentenyladenosine能够与TRAF6的功能结构域发生结合，导致下游靶蛋白AKT与TAK1的活性降低，这一系列信号反应的发生最终达到了癌细胞增殖受到抑制与细胞凋亡受到促进的目的，表明TRAF6可以作为一个潜在具有抗癌活性的药物作用靶蛋白。关键词：肿瘤坏死因子受体相关因子6，N6-

5、Isopentenyladenosine；HeLa，AKT，TAK1IABSTRACTTumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor6(TRAF6)isamemberoftheTRAFfamily,itisnotonlyoverexpressedinmanycancertissuesbutalsocloselyassociateswithtumorcellproliferation，migrationandapoptosis.AllofthestudyindicatethatTRAF6playanimportantroleintumor

6、.WeemploycomputerdrugdesigntofindoutthecompoundwhichcouldbindwiththeRINGfingerdomingandfirstZnfingerdomainofTRAF6.Thus,thecompoundwouldblocktheinteractionbetweenTRAF6andUbc13,whichisimportantfortheactivationofthedownstreampathway.WeevaluatedeffectsofN6-Isopentenyladenosineoncervicalcancercel

7、llineHeLausingMTTandflowcytometry.Inaddition,suppressionoftheanti-apoptoticproteinBcl-2andelevationofthepro-apoptoticproteinBaxwerealsoobserved.WeexaminedeffectsofN6-IsopentenyladenosineonactivationsofTRAF6-mediateddownstreamtargetsusingWesternblot