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1、枸杞多糖对人肝癌细胞Bel单铁英，赵如同，杨书良，潘秀兰，张红梅【摘要】目的研究枸杞多糖诱导人肝癌细胞Bel-7402的凋亡作用及其作用机制。方法体外培养的人肝癌细胞Bel-7402，细胞经不同剂量枸杞多糖(LBP)处理后,采用MTT法测定细胞的增殖情况,流式细胞仪分析LBP对Bel-7402细胞周期和凋亡的影响,用RT-PCR技术检测Bel-7402细胞SurvivinmRNA的表达。结果LBP可明显抑制人肝癌细胞Bel-7402的生长,并能诱导Bel-7402细胞凋亡,凋亡率(%)分别为(6.20±0.62)，(12.80±0.47)和(18.10
2、±0.70),与对照组比较,差异有非常显著性(P0.01);各剂量药物处理组的肿瘤细胞SurvivinmRNA表达水平均明显降低(P0.01)。结论枸杞多糖可抑制Bel-7402细胞增殖,诱导细胞凋亡,该作用可能与下调细胞Survivin表达有关。【关键词】肝癌;枸杞多糖;细胞凋亡;基因表达枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides,LBP)是枸杞子的提取物,具有多种生物活性作用1及抗肿瘤功能2,并能诱导肿瘤细胞凋亡从而抑制其增殖3。然而其诱导人肝癌细胞Bel-7402的凋亡及其机制尚未见报道。本文旨在探讨(LBP)对人肝癌细
3、胞Bel-7402凋亡的影响及其可能机制。1材料1.1药物与试剂人肝癌细胞株Bel-7402,.freela公司产品,Survivin及β-actin引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。1.2细胞株及其培养人肝癌细胞株Bel-7402置于RPMI1640培养液中(含10%胎牛血清和青霉素、链霉素各100U/ml),在37℃,饱和湿度,5%CO2培养箱中培养。待细胞进入对数生长期后,经0.25%胰蛋白酶消化,收集,调配成相应的细胞浓度。2方法2.1分组及处理实验设空白对照组、溶剂对照组和5个不同质量浓度实验组,分别为LBP200.freell。取对数
4、生长期的Bel-7402细胞1×104个/ml接种于25ml的培养瓶中培养,24h后加入前述不同质量浓度的LBP,作用48h后,胰酶消化离心,将细胞悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS)中,调质量浓度为1×106个/ml细胞悬液,备用。2.2LBP对人肝癌细胞株Bel-7402周期和凋亡的影响取实验组和对照组细胞样品,1000r/min离心10min,收集细胞,PBS洗涤2次,配成1×106/ml细胞悬液,75%冷乙醇(-20℃)固定24h,上机测定前,离心去乙醇,用PBS洗涤2次,加入不含Dnase的RNA酶及EB染液,室温反应30min,上流式细胞仪测定细胞
5、凋亡。2.3原位末端标记法(TUNEL)由武汉博士德公司提供TUNEL检测试剂盒。光学显微镜下,胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞。随机计数200个细胞,算出阳性细胞率。2.4RT-PCR检测SurvivinmRNA表达细胞分组及处理同方法“2.1”,按Trizol试剂说明提取细胞总RNA,进行RT-PCR扩增,扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,应用gel-pro凝胶分析软件对电泳谱带进行分析。引物序列及扩增条件见表1。表1Survivin及β-actinPCR引物序列及扩增条件2.5统计学方法所有的数据均用±s表示,采用SPSS软件包分析数据
6、,各组间指数的比较采用单因素方差分析。3结果3.1LBP对人肝癌细胞Bel-7402生长的影响3组不同质量浓度的LBP对体外培养的Bel-7402细胞均有抑制作用,且呈明显的剂量-效应关系,最大抑制率达65.49%。200μg/ml组与溶剂对照组比较,差异具有显著性(P0.05);400及800μg/ml组与溶剂对照组比较,差异有显著性(P0.01,表2)。表2LBP对人肝癌细胞Bel-7402生长抑制的影响3.2流式细胞仪检测枸杞多糖对Bel-7402细胞凋亡的影响不同剂量的枸杞多糖对Bel-7402癌细胞有显著的促进细胞凋亡作用,呈剂量依赖关系。在
7、DNA直方图的G1期峰前出现明显的细胞凋亡峰。枸杞多糖对Bel-7402细胞周期产生明显影响,G2/M期细胞明显增多,G0/G1期细胞比率明显减少,多数细胞阻滞在G2/M期。见表3。3.3LBP对Bel-7402细胞SurvivinmRNA表达的影响结果见图1。经不同浓度(200，400，800μg/ml)枸杞多糖处理48h后,Bel-7402细胞SurvivinmRNA表达水平的校正值(survivin/β-actin)分别为(0.725±0.11)、(0.317±0.04)和(0.204±0.04),随枸杞多糖浓度增加SurvivinmRNA表达水
8、平逐渐降低。400和800μg/ml处理组显著低于对照组(0.873±0.04)(P0.01)
