半夏蛋白对人肝癌细胞bel7402的诱导凋亡作用论文

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1、半夏蛋白对人肝癌细胞Bel7402的诱导凋亡作用论文【摘要】目的观察并比较半夏蛋白对体外培养的人肝癌细胞Bel7402的生长抑制作用。方法应用流式细胞技术，检测半夏蛋白对人肝癌细胞Bel7402的诱导凋亡作用，并观察了其诱导凋亡作用的量效关系。结果60%硫酸铵沉淀蛋白没有明显诱导Bel7402细胞凋亡的作用，而30%硫酸铵沉淀蛋白有诱导Bel7402细胞凋亡的作用。30%沉淀进一步分离结果显示，只有0.1mol/LNaCl洗脱峰有一定诱导Bel7402细胞凋亡的作用。结论半夏蛋白有一定的诱导Bel7402细胞凋亡作用，其主要成分可能存在于总有

2、机酸部位。【关键词】半夏提取物；人肝癌细胞Bel7402；细胞凋亡Abstract：ObjectiveTostudytheinducingapoptosiseffectsofPinelliaternateproteinonhumanhepatomacelllinebel7402.MethodsFloetryeeffects,and0.1mol/LNaCldepositoryproteinform30%(NH4)2SO4depositionalsoshoeeffects.ConclusionThePinelliaternateproteinhassomee

3、ffectsofinducingapoptosisofBel7402,andprobablythetotalorganicacidisthemaininducingapoptosisparts.KeyanhepatomacelllineBel7402;Apoptosis半夏临床上可单独或与其它药物配伍用于治疗食管癌、卵巢癌及肝癌等。近年来对抗癌中药的研究发现，其作用途径主要是通过杀伤癌细胞、抑制细胞生长、诱导细胞凋亡、调节机体免疫功能来实现的［1］。研究也发现，半夏乙醇提取液、半夏总有机酸、掌叶半夏蛋白分别对肝癌细胞（HepG2）、胃癌细胞及卵巢癌细胞具

4、有抑制作用［2～4］。然而不同产地半夏及其类似品所含的蛋白抗癌作用有何差异.freelresco公司；RPMI1640（GIBCO产品）；RNase酶、碘化丙啶（PI）均购自Sigma公司；胎牛血清、新生牛血清（三利生物制品厂）。醋酸乙酯、石油醚、95%乙醇等其它均为国产分析纯。1.3细胞系及培养人肝癌细胞系Bel7402由武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）提供，用50ml的培养瓶，将人肝癌细胞系（Bel7402）接种于含100u/ml青霉素、0.1g/L链霉素和10%新生牛血清的RPMI1640培养液中，细胞浓度为2×104ml，置于5%CO

5、2，37℃的培养箱中培养。1.4仪器SHELLRBCO2恒温细胞培养箱；Olympus倒置显微镜；SHZ82A恒温震荡器；无菌操作台（苏州净化设备厂）；流式细胞仪（BD公司FACSCalibur型）；高速冷冻离心机（上海安亭离心机厂）；902型定时恒温磁力搅拌器；LDZX40立式电热压力蒸气灭菌器等。2方法及结果2.1半夏蛋白的提取分离新鲜块茎半夏洗净去皮，加入4倍体积0.05mol/LTrisHcl(pH8.0)缓冲液及少量石英砂，高速匀浆后离心（8000r/min，30min），收集上清液，即得粗蛋白。粗蛋白冷却到0℃，逐步加入固体（NH4）2S

6、O4，当饱和度达到30%时，4℃静置2h离心（8000r/min，30min），收集沉淀，得第1个分级沉淀部分。上清液继续加（NH4）2SO4至60%饱和度，4℃静置2h后离心（8000r/min,30min），收集沉淀，得第2个分级沉淀部分。上清液加（NH4）2SO4至90%饱和度，静置无沉淀。将上述2个分级沉淀部分分别用蒸馏水溶解，装入透析袋（透过分子量8000），用蒸馏水在4℃透析脱盐，更换透析液在检测不出（NH4）2SO4为止，把透析袋放入吸水性强的聚乙二醇（PEG，分子量20000）中，浓缩至小体积离心后去除沉淀。将层析柱竖直固定在仪器车上，将DE

7、AESepharoseFF胶装入层析柱中，用0.05mol/LTrisHCl(pH8.0)缓冲液平衡树脂，将30%（NH4）2SO4沉淀部分溶解后以0.5ml/min上柱，分别以0.05mol/LTrisHCl，0.05mol/LNaCl,.freelol/LNaCl,0.15mol/LNaCl,0.20mol/LNaCl溶液以1ml/min速度洗脱，用HD3紫外检测仪测定A280，共出现4个比较明显的吸收峰，分别收集各峰，透析脱盐，浓缩。2.2半夏蛋白对Bel7402细胞凋亡的影响操作方法同2.1项，样品用PBS溶解，终浓度也为0.05mg/ml，

8、空白对照加入等体积PBS，其它方法同前，结果见表1，