大豆菌核病生防菌克ｈ３菌株发酵条件研究.doc

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1、大豆菌核病生防菌克H3菌株发酵条件研究摘要：通过对大豆菌核病生防菌克H3菌株发酵条件的研究表明，适宜克H3菌株生长的培养基是自制培养基，最适温度35°C，适宜pH值〜，最佳发酵时间48h，克H3生长曲线表明，6〜18h为该菌延迟期，18〜30h为对数生长期，30〜54h为稳定期，54h后进入衰退期。关键词：大豆菌核病；克H3;发酵条件1材料与方法1.1供试培养基①PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。②高氏1号培养基：可溶性淀粉20g，KN031g,K2,MgS03*7H20,,水lOOOmLo

2、③肉汁蛋白胨培养基：牛肉膏5g，NaC15g，蛋白胨10g，水1000mLo④玉米粉培养基：玉米300g，水10⑻mL。⑤YPG培养基：酵母浸膏8g，酵母膏2g，，K2HP042g，水1OOOrnL。灭菌后加入无菌10%葡萄糖50mL和1匾gS04•7H201mL，pH值。⑥BPY培养基：牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖5g，蛋白胨10g，NaC15g,水lOOOmL。pH值。⑦自制培养基：豆粉10g，葡萄糖10g，酵母膏5g，水lOOOmLo1.2主要仪器设备HYA恒温摇床（中国科学院武汉仪器厂），O-lympus显

3、微镜（日本奥林巴斯株式会社），PHS-3C型酸度计（金坛市泰纳仪器厂），电热恒温培养箱（南京电器三厂），手提式高压灭菌锅（哈尔滨东联电子公司），超净工作台（上海精密仪器仪表厂）。1-3.1克H3菌株发酵液的制备将活化的克H3菌株用接菌环划线接种于肉汁蛋白胨培养基斜面上，30°C恒温培养2d后，每试管用5mL无菌水配成克H3悬浮液，将5mL的克H3悬浮液置于装有lOOmLPDA培养液的250mL三角瓶中，在35°C、180r/min摇床中培养48h制成发酵液。1.3.2抑菌活性的测定方法采用滤纸片法。在培养基一侧放人直

4、径8ram的已灭菌的圆形滤纸碟片，用移液枪接种克H3悬浮液5uL，另一侧放人核盘菌（6腿），菌间相距3cm。每处理3次重复，5d观察拮抗效果，测量抑菌带宽度。1.3.3最佳培养基的选择供试培养基为PDA培养基、高氏1号培养基、肉汁蛋白胨培养基、玉米粉培养基、YPG培养基、BPY培养基和自制培养基，将5mL的克H3发酵液分别置于装有lOOmL上述培养基的250mL三角瓶中，在35°C、180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵液测定抑菌活性。每处理3次重复。1.3.4培养温度的测定处理温度为20〜40°C，梯度为5

5、°C，将5mL的克H3发酵液置于装有10OmL自制培养基的250mL三角瓶中，在180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵液测定抑菌活性。每处理3次重复。1.3.5起始pH值的测定用PHS-3C型酸度计将自制培养基中的pH值调节为〜10间隔为。将5mL的克H3发酵液置于装有1OOmL自制培养基的250mL三角瓶中，在35°C、180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵液测定抑菌活性，每处理3次重复。1.3.6培养时间的确定将5mL的克H3发酵液置于装有lOOmL自制培养基的250mL三角瓶中，在35°C、18

6、0r/min摇床中震荡培养。每间隔12h取发酵液测定抑菌活性，至72h结束，共取样6次。1.3.7培养基装液量的确定在250mL三角瓶中分别装入25、50、75、100、125、150mL的自制培养基，接种5°/。的克H3发酵液，在35°C、180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵液测定抑菌活性。1.3.8接种量的确定分别按1、2、5、7、10、20、30mL接种量接人lOOmL自制培养基中，在35°C180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵产物测定抑菌活性。1.3.9摇床转速的确定250mL三角瓶中装入

7、自制培养基lOOmL,接种5mL克H3发酵液后，分别在160、180、200、220r/min摇床中35°C震荡培养48h后，取发酵液产物测定抑菌活性。1.3.10克H3菌株生长曲线在250mL三角瓶中装入lOOmL自制培养基，加入克H3发酵液5mL，在最适温度、最适pH值下180r/min恒温振荡培养后，以6h为时间间隔取样，即6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72h分别取样，稀释平板法测定每毫升菌落个数。2结果与分析2.1不同培养基对克H3抑菌活性的影响玉米粉培养基、roA培养基培养

8、的克H3菌株抑菌活性较差，抑菌带宽＜10mni，高氏1号培养基、肉汁蛋白胨培养基、YPG培养基、BPY培养基和自制培养基培养的克H3菌株对核盘菌的抑菌活性较强，其中自制培养基的抑菌活性最强，抑菌弗^见。2.2不同温度对克H3抑菌活性的影响结果表明，20〜40°C克H。菌株对核盘菌均有抑菌活性。20〜25°C克H3菌株抑菌活性较弱，抑菌带宽＜(1