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时间:2018-11-22
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1、大豆菌核病生防菌克H3菌株发酵条件研究 摘要:通过对大豆菌核病生防菌克H3菌株发酵条件的研究表明,适宜克H3菌株生长的培养基是自制培养基,最适温度35℃,适宜pH值7.0~8.5,最佳发酵时间48h,克H3生长曲线表明,6~18h为该菌延迟期,18~30h为对数生长期,30~54h为稳定期,54h后进入衰退期。 关键词:大豆菌核病;克H3;发酵条件 1材料与方法 1.1 供试培养基 ①PDA培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g,水1000mL。②高氏1号培养基:可溶性淀粉20g,KNO
2、31g,K2HPO40.5g,MgSO3·7H2O0.5g,Fe-SO40.01g,水1000mL。③肉汁蛋白胨培养基:牛肉膏5g,NaCl5g,蛋白胨10g,水1000mL。④玉米粉培养基:玉米粉300g,水1000mL。⑤YPG培养基:酵母浸膏8g,酵母膏2g,KH2PO40.5g,K2HPO42g,水1000mL。灭菌后加入无菌10%葡萄糖50mL和1MMgSO4·7H2O1mL,pH值7.2。⑥BPY培养基:牛肉膏5g,酵母膏5g,葡萄糖5g,蛋白胨10g,NaCl5g,水1000mL。pH值7
3、.2。⑦自制培养基:豆粉10g,葡萄糖10g,酵母膏5g,水1000mL。 1.2主要仪器设备 HYA恒温摇床(中国科学院武汉仪器厂),O-lympus显微镜(日本奥林巴斯株式会社),PHS-3C型酸度计(金坛市泰纳仪器厂),电热恒温培养箱(南京电器三厂),手提式高压灭菌锅(哈尔滨东联电子公司),超净工作台(上海精密仪器仪表厂)。 1.3试验方法 1·3.1克H3菌株发酵液的制备 将活化的克H3菌株用接菌环划线接种于肉汁蛋白胨培养基斜面上,30℃恒温培养2d后,每试管用5mL无菌水
4、配成克H3悬浮液,将5mL的克H3悬浮液置于装有100mLPDA培养液的250mL三角瓶中,在35℃、180r/min摇床中培养48h制成发酵液。 1.3.2抑菌活性的测定方法 采用滤纸片法。在PDA培养基一侧放人直径8ram的已灭菌的圆形滤纸碟片,用移液枪接种克H3悬浮液5μL,另一侧放人核盘菌(6mm),菌间相距3cm。每处理3次重复,5d观察拮抗效果,测量抑菌带宽度。 1.3.3最佳培养基的选择 供试培养基为PDA培养基、高氏1号培养基、肉汁蛋白胨培养基、玉米粉培养基、YPG培养基、BPY
5、培养基和自制培养基,将5mL的克H3发酵液分别置于装有100mL上述培养基的250mL三角瓶中,在35℃、180r/min摇床中震荡培养48h后,取发酵液测定抑菌活性。每处理3次重复。 1.3.4培养温度的测定 处理温度为20~40℃,梯度为5℃,将5mL的克H3发酵液置于装有100mL自制培养基的250mL三角瓶中,在180r/min摇床中震荡培养48h后,取发酵液测定抑菌活性。每处理3次重复。 1.3.5起始pH值的测定 用PHS-3C型酸度计将自制培养基中的pH值调节为5.5~10,间隔为
6、0.5。将5mL的克H3发酵液置于装有100mL自制培养基的250mL三角瓶中,在35℃、180r/min摇床中震荡培养48h后,取发酵液测定抑菌活性,每处理3次重复。 1.3.6培养时间的确定 将5mL的克H3发酵液置于装有100mL自制培养基的250mL三角瓶中,在35℃、180r/min摇床中震荡培养。每间隔12h取发酵液测定抑菌活性,至72h结束,共取样6次。 1.3.7培养基装液量的确定 在250mL三角瓶中分别装入25、50、75、100、125、150mL的自制培养基,接种5%的克
7、H3发酵液,在35℃、180r/min摇床中震荡培养48h后,取发酵液测定抑菌活性。 1.3.8接种量的确定 分别按1、2、5、7、10、20、30mL接种量接人100mL自制培养基中,在35℃、180r/min摇床中震荡培养48h后,取发酵产物测定抑菌活性。 1.3.9摇床转速的确定 250mL三角瓶中装入自制培养基100mL,接种5mL克H3发酵液后,分别在160、180、200、220r/min摇床中35℃震荡培养48h后,取发酵液产物测定抑菌活性。 1.3.10克H3菌株生长曲线 在
8、250mL三角瓶中装入100mL自制培养基,加入克H3发酵液5mL,在最适温度、最适pH值下180r/min恒温振荡培养后,以6h为时间间隔取样,即6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72h分别取样,稀释平板法测定每毫升菌落个数。 2结果与分析 2.1不同培养基对克H3抑菌活性的影响 玉米粉培养基、PDA培养基培养的克H3菌株抑菌活性较差,抑菌带宽<10mm,高氏l号培养基、肉汁蛋白胨培养基、YPG
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