microrna表达检测技术进展

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1、microRNA表达检测技术进展Andy(2010-09-1316:08:20)中华临床医师杂志征稿神经性疼痛疾病诊疗班胸部疾病影像诊断班心律失常现代诊疗会议医学类核心期刊征稿治未病调理师培训班医院药学新进展会议第13届国际急诊学大会四届屮华消化病学讲坛2010屮M介入治疗论坛全国疑难重症肝病大会青光眼规范诊疗论坛2010世界心脏病学大会全国静脉治疗护理论坛股骨头坏死修复论坛作者：张宇，张勇，杨长成，王振宁作者单位：1.中国医科大学附属第一医院肿瘤外科，辽宁沈阳110001;中国医科大学附属第一医院普通外科教研室胃肠肿瘤外科，辽

2、宁沈阳110001;2.沈阳市肛肠医院肛门病科，辽宁沈阳110002【摘要】microRNA(miRNA)是一类新发现的非编码、闪源性小RNA分子，通过与靶基因mRNA结合参与多种基因的表达凋控。miRNA表达的检测技术主要以杂交和反转录聚合酶链反应(RTPCR)为主。近年来，这些技术不断得到改进，例如，RNA加尾和引物延伸在RTPCR技术中的应用，为深入研究miRNA功能提供了有力的工具。现对检测miRNA表达的相关技术进展加以综述。【关键词】miRNA；表达调控；检测技术microRNA(miRNA)是一类非编码、内源性的小

3、RNA，长约21〜25核宵酸(nucleotides，nt)。经预测，人类基因组编码了超过1000种不同的miRNA［1］。近年来国内外研究已经在动梢物体闪证实了数百种miRNA［2］,并确定了少数miRNA的功能，但大部分miRNA的功能尚不清楚［3］。解决这一问题的首要环节是找出各miRNA在组织或细胞中表达的组织和时序特异性。自1993年首次发现miRNA以来，检测K•表达水平的技术方法迅速发展，虽然传统方法如Northern杂交技术等仍在miRNA表达检测中起着重要作用，但许多针对miRNA检测的新技术方法不断涌现，为深

4、入研究miRNA提供了更多的帮助。在此，作者对传统及最新发展的miRNA表达检测方法作一简要综述，以期对miRNA研宄提供一些思路和启发。1miRNA简介1993年，Lee等［4］在对线虫的研究屮发现了首个miRNAlin4,当时有研究指出lin4可以抑制lin14蛋白表达，但机制不清。直至2000年，发现第2个miRNAlet7［5］及其在人类和果蝇中同源体后，人们逐渐认识到miRNA是一类进化保守，在生物进化［6］和疾病发展过程中起着调控作用的重要分子，通过抑制靶基因的表达产生基因沉默效应［78］。越来越多的miRNA得到鉴

5、定，目前估计人类miRNA总数在800种以上，是最初预测miRNA种类的3倍以上［9］。miRNA生物合成是一个复杂的过程，首先在细胞核内由miRNA基因转录产生primiRNA,primiRNA经Drosha切割作川释放出长约70nt的茎环结构一premiRNA［10］;premiRNA转运至细胞质后经过酶的修饰作用形成成熟的miRNA。miRNA与RNase、解螺旋酶等活性分子构成RNA诱导沉默复合体(RNAinducedsilencingcomplex,RISC)oRISC通过特异地锚定在靶mRNA上介导目的mRNA的切割

6、或翻译抑制，从而调控目的基因的表达。2miRNA检测技术2.1Northern杂交Northern杂交是检测miRNA表达的一种简便而可靠方法［11］，不仅用于检测miRNA在姐织细胞中的表达水平，而且结合RNAmarker,可经凝胶电泳检测miRNA的分子大小。1993年始，Northern杂交应用于miRNA表达谱研究，也是首个用于半定量检测miRNA的实验技术，通过将已知浓度梯度的寡核苷酸参照物与待测样品进行平行杂交，实现对miRNA的半定y:检测［12］。而后，Northern杂交成为检测细胞屮miRNA表达的常规研究方

7、法之一。Hayashita等［B］用该技术比较正常细胞和肺癌细胞屮的表达情况，发现miR1792在肺癌中的表达明显升高。Sempere等［11］用该技术检测了已知的119个miRNA表达谱，发现一部分在特异组织中表达，一部分无特异性，且在不同组织中表达水平各异。Northern杂交最大的缺点是对样品的需求量较商，需要微克级样品才能避免假阴性，有时样品量达到40pg才会出现明品杂交信号。2.2原位杂交原位杂交分为细胞和组织内原位杂交，该技术检测miRNA表达，可更直观的展示出miRNA的时空表达模式。80年代后期可在福尔马林固定、

8、石蜡包埋的组织中进行原位杂交,近年来扩展到细胞及亚细胞水平进行miRNA的检测［10］。该技术不仅可以检测不同细胞系单个细胞屮的miRNA表达，还可在不经分类和分离的情况下，比较不同细胞系屮miRNA的表达水平。Wienholds等［14］首次将LNA探针(lo