标本处理(核酸纯化)程序

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1、实验室主题文件编号F07临沧市第二人民医院检验科分子生物实验室标本处理（核酸纯化）标准操作程序第1页共4页第1版第0次修改撰写日期：2015.11.201目的：保证标本处理标准化、规范化，使不规范操作因素对实验结果造成的影响减至最小。2适用范围：乙型肝炎病毒核酸提取、解尿支原体核酸提取、沙眼衣原体核酸提取、HPV核酸提取、HCV核酸提取、结核杆菌核酸提取、淋球菌核酸提取。3操作人：李成庭、李丽蒙、高子文李华娇张国华4标准操作程序4.1乙型肝炎病毒（DNA血清）1）双手戴上手套，从冰箱取出标本，将离心管依次编号。2）取出1.5ml离

2、心管，对应标本编号，置于离心管架上。3）将移液器调到70µl，先混匀DNA提取液，再吸取70µl加入到已编号的离心管中。然后吸取30µl血清，加入离心管中混匀，注意每吸取一份血清标本应更换一次枪头。处理全部标本，然后将离心管插到金属浴孔内，100℃加热10分钟。4）裂解完成后将离心管取出，然后10000rpm离心5分钟，取上清液20µl加样上机。5）收拾台面至准备状态。4.2CT、UU、NGHDNA（分泌物）1）双手戴上手套，从冰箱取出标本，将化验单和离心管依次编号。2）5双手换上新手套，取出1.5ml灭菌离心管，对应标本编号，置

3、于离心管架上。3）向有棉拭子的离心管中加入2ml无菌生理盐水，振荡混匀，将混悬液用移液器吸取1.0ml加入到已编号的离心管中。10000rpm离心5分钟，弃上清液，留取沉淀加50微升DNA提取液混匀，金属浴100℃加热10分钟。4）裂解完成后取出离心管，然后10000rpm离心5分钟，取上清液2µl加样上机。5）收拾台面至准备状态。4.3结核杆菌（DNA痰液、胸腹水等）1）双手戴上手套，从冰箱取出标本，将化验单和离心管依次编号。2）双手换上新手套，取出1.5ml灭菌离心管，对应标本编号，置于离心管架上。3）用移液器吸取4倍体积4%

4、NaOH到痰液容器，液化30分钟，用移液器调吸取1ml加入到已编号的离心管中，然后10000rpm离心5分钟，弃上清，留取沉淀，用无菌生理盐水洗涤两次，沉淀加50ulDNA提取液，充分震荡混匀。胸腹水、脑脊液直接混匀后，用移液器调吸取1ml加入到已编号的离心管中，然后10000rpm离心5分钟，弃上清，留取沉淀，加50ulDNA提取液，充分震荡混匀。然后将离心管插到金属浴孔内，100℃加热10分钟。4）裂解完成后将离心管取出，然后10000rpm离心5分钟，取上清液2µl加样上机。5）收拾台面至准备状态。54.4丙型肝炎病毒RNA

5、（血清）1)双手戴上手套，从冰箱取出标本，将离心管依次编号。2）取出1.5ml灭菌离心管，对应标本编号，置于离心管架上.3)1.5ml无菌管加入50ul蛋白酶K→200ul血清→200ul裂解液混匀72℃加热10min（同时将洗脱液72℃预热）→加入250ul无水乙醇→将混合液全部吸至离心柱12000rpm/1min→将离心柱装在新的收集管中→加500ul抑制物去除液12000rpm/1min→将离心柱装在新的收集管中→加500ul去离子液12000rpm/1min→将离心柱装在新的收集管中→再加500ul去离子液12000rpm

6、/4min→将离心柱装在1.5ml的离心管中，开盖72℃/2min→在离心柱正上方加入72℃预热的洗脱液35ul,盖盖14000rpm/1min,离心管内即病毒核酸溶液，最好立即使用，如需保存，置-20℃。注：配试剂蛋白酶K+1.375ml洗脱液，混匀，-20℃保存CarrierRNA+110ul内标液混匀，-20℃保存去离子浓缩液+44ml无水乙醇裂解工作液:1人份病毒裂解液200ul+CarrierRNA4ul,现用现配（根据标本数依次增加）。PCR试剂HCV反应液A-2ul,HCV反应液B-3ul,HCV反应液C-25ul混

7、匀（根据标本数依次增加）。4.5乳头瘤病毒DNA（宫颈样本）1)双手戴上手套，从冰箱取出标本，将离心管依次编号后。52）取出1.5ml灭菌离心管，对应标本编号，置于离心管架上.3）向有样本刷的离心管中加入2ml无菌生理盐水，振荡混匀，将混悬液用移液器吸取1.0ml加入到已编号的离心管中。10000rpm离心5分钟，弃上清液，留取沉淀加50微升DNA提取液混匀，金属浴100℃加热10分钟。裂解完成后将离心管取出，然后10000rpm离心5分钟，取上清液5µl加样上机。起草人校对人批准人生效日期李丽蒙高子文李成庭2015.11.255

8、标本处理（核酸纯化）标准操作程序5