红色毛癣菌指甲培养上清对HaCaT天然免疫应答的影响

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1、中山大学硕击学位论文红色毛疲菌指甲培养上清对ＨａＣａＴ天然免疫应答的影响ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｕｅｒｎａｔａｎｔｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｈｔｏｎｒｕｂｒｕｍｒｏｗｎｉｎｔｈｅｐｐｙｇｎａｉｌｍｅｄｉｕｍｏｎｔｈｅｉｎｎａ化ｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆＨａＣａＴ专业名称：分子医学申请人：黄新珠指导老师：陈剑副主任医师答辩委员会主席：答辩委员会委员：学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的

2、指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日中山大学硕壬学位论文红色毛癖菌指甲培养上清对ＨａＣａＴ天然免疫应答的影响专业；分子医学硕壬生；黄新珠指导教师：陈剑副主任医师摘要【背景】红色毛癖菌在感染人体时主要侵袭皮肤的角质层，该个现象提示皮肤角

3、质形成细胞可能在红色毛癖菌感染中发挥重要的免疫调控作用，并且大部分的角质形成细胞只能通过不依赖接触菌体的方式参与抗感染免疫，因此，和菌体表面的病原相关分子模式相比，红色毛癖菌游离性病原相关分子模式可能发挥更重要的免疫调控作用。现在有很多研究表明，包括红色毛癖菌在内的皮肤癖菌的培养上清，可Ｗ有效地刺激角质形成细胞产生免疫应答，但该些研究都是采用完全培养基，在该些培养基中红色毛癖菌可Ｗ直接利用小分子营养物质，不需要粘附和侵袭宿主的角蛋白，因此在该种培养条件下，其免疫原性和致病性和活体感染有

4、很大区别，可能无法真实的反映红色毛癖菌感染人体时所产生的游离性病原相关分子模式对角质形成细胞天然免疫的影响。在一本次研究中，我们采用Ｗ指甲作为唯碳源和氮源的培养基体外培养红色毛癖菌，在一该培养基中，红色毛癖菌必须粘附、侵袭角质才能生长，更好的模拟了红色毛癖菌感染人体的真实情况，通过此种培养方式获得的上清液来研究红色毛癖菌释放的游离性病原相关分子模式对角质形成细胞的免疫调节作用。【目的】分析红色毛癖菌指甲培养上清对角质形成细胞天然免疫应答的影响，并比较不同菌株的差异。【方法】

5、本实验使用了两株红色毛癖菌，红色毛癖菌标准株ＣＭＣＣ＃Ｔｌａ，由中国卫生部微Ｉ紅色毛痛菌指甲培养上清对ＨａＣ押天然免疫应答的影响一、医学真菌中屯、赠予生物菌种保藏管理中屯。菌株Ｔｘｈｂ是从名体癖患者身上分离出来的临床株一。在无机盐溶液中加入正常人的指趾甲粉末作为培养基碳源和氮源的唯来源，体外振荡培养红色毛癖菌，过滤除菌并超滤浓缩获得培养上清。研究采用Ｗ下方法：一１－．采用整Ｇ因子试剂盒检测两株菌培养上清液中的Ｐ葡聚糖（种最常见的病原相关分子模式）的含量。２．用ＢＣＡ蛋白定量

6、法检测上清液蛋白浓度，通过细胞形态学方法确定与细胞共解育的上清液浓度。３．通过相对定量巧Ｃ民测定ＨａＣａＴ的抗真菌感染免疫密切相关的模式识别受体Ｄｅｃｔｉｎ－１ＴＬＲ２ＴＬＲ４ＤＣ－ＳＩＧＮ）ｅｃｔｉｎ－１、（，，，、Ｄ的下游信号通路分子ＣＡＲＤ９在皮肤中组成性表达的抗菌肤ＲＮａｓｅ７和中性粒细胞趋化因子正－８的ｍＲＮＡ表达水平。【结果】１．红色毛癖菌Ｔｌａ和Ｔｘｈｂ的培养上清中分别含有８７．５３０±３７．５８１／ｍｌ和１５．７４７±ｐｇ６－．４５３ｐｇ／ｍｌ的Ｐ葡

7、聚糖。２ＨＴ４０Ｔｌ２４．ａＣａ用蛋白终浓度大于鸭／ｍｌ的红色毛癖菌ａ上清处理ｈ，细胞开始脱落，多核细胞增加，开始出现明显的细胞毒性。两株红色毛癖菌菌株上清的蛋白终浓度２０鸭／ｍｌ处理ＨａＣａＴ，在４８ｈ内细胞形态均保持正常没有受到严重伤害，因＇２０１＾此我们用蛋白终浓度为＾ｉｇ／ｍｌ的红色毛癖菌上清刺激£３１。３．与同时间点的阴性对照相比，Ｔｌａ或Ｔｘｈｂ上清短时间解育６ｈ可Ｗ引起ＨａＣａＴ的ＴＬＲ２、ＴＬＲ４和ＣＡＲＤ９的ｍＲＮＡ表达的低强度上调咕＜０．０５）。不过，ＨａＣａＴ

8、对Ｔｌａ培养上清的应答比对Ｔｘｈｂ的更加显著。Ｔｌａ在６ｈ和２４ｈ时都上调了ＣＡＲＤ９＜－的表达，比Ｔｘｈｂ的６ｈ的上调时间更长，上调幅度都在２倍左右咕０．０５）。ＤＣＩ？ＳＧＮ的ｍＲＮＡ在Ｔ１ａ上清刺激３ｈ和６ｈＷ后上调，表达量是阴性对照的２４＜００５Ｔｌ倍，而Ｔｘｈｂ上清引起的上调发生在２４ｈ，上调幅度较低咕．）。在ａ上清－的刺激下，Ｄ