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《髓源性神经干细胞与运动神经元的mirna的表达谱测定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、髓源性神经干细胞与运动神经元的miRNA的表达谱测定 微小的RNA简称miRNA,是一种在真核生物中体内发现一种具有很强的内源性和调控性的RNA,这种RNA的长度大约在20~24个核苷酸之间,它们之间相互联系,共同通过蛋白质的表达谱来决定细胞是否进行分化以及正常的胚胎发育.目前对于髓源性神经干细胞与运动神经元细胞的研究引起了人们的关注,而比较二者差异的前提就是对于二者的miRNA表达谱进行准确的测量以及定量分析.髓源性神经干细胞与运动神经元的miRNA表达谱测定技术中的TaqMan低密度阵列(TaqManloiRNA的表达谱测定,现报道如下. 1材料与方法 1.1一般材料本次
2、实验主要采用的主要是生产商家AppliedBiosystems生产的与脊髓源性神经干细胞和神经元的miRNA相关的实验的试剂,比如TaqMangeneexpressionmastermix、TranscriptionKit等等.其次就是本次实验常用的实验仪器,比如紫外分光光度仪、7300荧光定量PCR系统等等.另外本次实验还需要配制一定量的RNase-free水,其主要目的是用来抽提RNA或反转录用.RNase-free水的配置过程中需要使用RNase-free玻璃瓶,然后向超纯水中加入DEPC至终浓度为0.01%(v/v)即可[1]. 1.2主要技术方法本次实验和研究主要采用的
3、是AppliedBiosystems公司的TLDA技术实现对miRNA表达谱的技术检测.对于miRNA表达谱进行检测的一般步骤或是流程主要包括以下几个方面.第一步是对于实验相关的神经干细胞以及运动神经元的培养,供以下的实验所用.第二步是对已培养的细胞的总RNA所谓提取与纯化,以及对于提取RNA的浓度和纯度进行测定和记录.另外我们采用免疫磁珠法对于脊髓细胞神经元进行纯化.第三步是利用Megaplex对RNA进行逆转录,从而获取细胞标本中隐含着的miRNAs的cDNA文库,并综合利用实时PCR技术对于提取的cDNA的产物进行质量检测.其中对于RNA的浓度的测量就用到了我们已经配制好的R
4、Nase-free水,同时RNA的纯度应该在1.8~2.0之间.对cDNA的产物进行质检的主要目的是初步验证该产物是否可用于随后miRNA的TLDA筛选.第四步则是采用TLDA对二者的表达光谱进行检测,利用定量PCR平台进行miRNAs的定量.第五步则是对于每一步的实验数据以及实验现象进行总结和分析[2]. 1.3观察标准对于髓源性神经干细胞与运动神经元反转录的cDNA产物,我们会分别利用ArrayA和ArrayB中的U6snRNA进行了扩增,然后对二者的结果通过PCR平台进行定量,分析定量结果[3].同时根据TLDA对二者的表达光谱的检测结果,对于运动神经元中的表达信息进行确定
5、. 1.4统计学处理通过RQStudy软件对于实验进行定量分析,定量的结果以及组间比较采用GraphPadPrism5软件进行t值检验,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,以P<0.05为显着性检验标准. 2结果 2.1ArrayA和ArrayB中的U6snRNA表达情况在利用ArrayA和ArrayB中的U6snRNA进行了扩增之后,通过PCR平台对于二者的Ct值进行了比较,具体的比较结果表1所示.通过对于二者的Ct值进行比较,很明显可以看出它们之间的差异很小,说明一致性很好,可以进行下一阶段的表达光谱检测. 2.2髓源性神经干细胞与运
6、动神经元的miRNA表达谱检测结果通过TLDA对于二者的miRNA表达色谱的测量结果总结,以及对于图像的分析,髓源性神经干细胞与运动神经元两种细胞的扩增曲线呈现出明显的S形曲线,可见二者的表达性差异.通过对定量结果的及时调整和分析,当相差倍数的绝对值大于2的时候,在运动神经元中高表达的miRNA共有60个,低表达的miRNA共有35个,由此我们鉴定了运动神经元中的基本表达信息[4]. 为了进一步验证TLDA技术的特异性以及结果的可靠性,本次实验还会采用具有高度特异性的单管qPCR方法,对于4种具有代表性的TLDA筛选出来的4种具有差异性的miRNA进行表达检测,并对检测结果进行定
7、量结果分析,并进行相关线性比较,经过模拟曲线得出线性相关r=0.978,P=0.017.具体的分析结果如表2所示. 3讨论 传统的脊髓运动神经元细胞的培养主要采用的是机械或是酶学的方法进行,这样在对单个细胞进行分离之后就可以将分离出来的细胞的悬液直接进行体外培养,这种方法不仅复杂而且耗时、耗费材料.在本实验中我们采取的是免疫磁珠法,不仅耗用的时间少,而且可以很好的保持细胞的活性,目前取得了良好的应用效果[5,6].miRNA是一种很长的非编码的小的RNA,在不同的
