蛋白质浓度测定考马斯亮蓝染色法(实验报告)

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1、蛋白质浓度测定一一考马斯亮蓝染色法（实验报告）实验日期：2015年4月28.EI实验温度：皇逼实验地点：生物化学与遗传学实验室指导老师：***班级：2013级生物技术1班姓名：本本学********I.实验目的1.学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法；2.熟悉蛋白质含量测定的影响因素。II.实验原理考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸收波长465nm,与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收波长595nm

2、,在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含量成正比。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合，反应2min即可到达平衡，复合物在室温下lh内保持稳定。蛋白质一考马斯亮蓝G-250复合物吸光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。III.实验试剂与仪器1.实验试剂(1)100pg/mL标准蛋白质溶液5mg酪蛋白溶于50mL的O.lmol/L氢氧化钠溶液。(2)考马斯亮蓝G-250试剂50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL的95%乙醇中，加85%的磷酸50mL，蒸馏水定容至500mLo(3)正常人i浆。1.实验

3、器材可见分光光度计，100

4、iL微量移液器16支，5mL刻度吸管8支，中试管。IV.实验操作步骤mL012345样品1样品2标准蛋白质溶液00.20.40.60.81.0■一血浆00.80.60.40.200.40.4O.lmol/LNaOH一■一一■—0.60.6考马斯亮蓝试剂各5.01.绘制标准曲线取中试管8支，按下表加入各种试剂混匀，室温放置5min后即可比色。以“0”号管为空白记录于下表，绘制标准曲线。标准曲线绘制数据表012345样1样2标准蛋白pig数020406080100A59500.5170.8050.9

5、411.1571.1921.4651.4401.样品测定中试管2支分别加未知浓度蛋白质（或人正常血浆）0.4mL，各加5.0mL考马斯亮蓝试剂摇匀，室温放置5min，以“0”号管为空白比色，以所测A595于标准曲线查蛋白质含量。V.实验结果分析,11AQ11.157■‘0.8050.941a‘0.517标准曲线1.41.210.80.60.40.20♦A595204060称准蛋白8000丄2J结果分析：实验未能达到预期的一条直线，原因可能为：①血浆样本放置时间太久，蛋白质变性；②实验比色杯由于使用后未及时擦洗，导致比色误差

6、（原因小）；③人为操作不当，导致误差。VI.注意事项1.考马斯亮蓝试剂加入后室温放置5〜20min内比色，布的超过lh;2.蛋白质-染料复合物少量附于比色杯，不影响测定，可用乙醇洗净。