不同果蔬中过氧化物同工酶分离和活力测定

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1、不同果蔬中过氧化物同工酶分离及活力测定叶盛珺3100100231胡梦琦陈凯利目的：1、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理2、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程3、学习过氧化物酶同工酶电泳过程及活性测定方法原理：过氧化物同工酶同工酶是指其催化的化学反应相同，而酶的结构、理化性质乃至免疫性质不同的一组酶。植物在发育过程中，所含同工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，因此作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有重要的

2、意义。过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，测定这种酶的活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带。过氧化物酶能催化过氧化氢使联苯胺氧化成蓝色或棕色产物，据此即可将该酶在凝胶中显色定位。以大豆、绿豆为材料，低速离心去除细胞碎片，得过氧化物酶同工酶粗品。以愈创木酚为过氧化物酶的底物，在过氧化物酶的催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产

3、物在470nm处有最大吸收值，故可通过测定470nm处的吸光值的变化可以测定过氧化物酶的活性。电泳分离测定过氧化物酶粗提取分光光度计活性测定方法一聚丙烯酰胺凝胶电泳分离测定一、原理：1、聚丙烯酰胺凝胶的形成、结构及特性聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）和N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）聚合而成的大分子。凝结过程：过硫酸铵溶于水产生大量自由基，引发Acr与Bis也形成自由基，在四甲基乙二胺（TEMED）催化下这些自由基之间进行反应而聚合成凝胶。聚丙烯酰胺凝胶是具有立体（三维）网状结构的大分子。2、聚丙烯

4、酰胺凝胶电泳原理凝胶电泳具有一般电泳的电场效应，即在一定pH的溶液中，样品分子由于解离或吸附，使自身带一定的电量，在相同的电场强度作用下，不同的样品分子因带不同的电性和电量，电泳时具有不同的泳动速度，使最终的迁移距离不同而分离。凝胶电泳与其他电泳的重要区别是它除了有电场效应外，还具分子筛效应：凝胶是一种立体网状结构物质，样品分子在通过凝胶网孔时受到摩擦力等的作用，其结果：体积小、且为圆球状的样品分子受到的阻力较小，移动较快，而体积大，形状不规则的样品分子受到的阻力较大，移动较慢。因此，凝胶电泳不但从分子

5、带电情况的差别，而且还从分子大小、形状等方面的差别来分离样品分子，具有很高的分辨力。聚丙烯酰胺凝胶常分为两大类，一类是连续的凝胶，另一类为不连续的凝胶。前者凝胶系统的pH值、凝胶孔径是均一的，电泳过程中缓冲系统的离子强度及溶胶体系的各部分电位梯度都是一致的。而后者则刚好相反；前者电泳时只有电场和分子筛两种物理效应，而后者除此外还有样品的浓缩效应，故具更好的分离效果。样品分子在上层大孔径的浓缩胶中快速移动到小孔径的下层分离胶时，由于凝胶孔径突然变小而移动速度大大减慢，使之在浓缩胶与分离胶的界面处被浓缩成一

6、狭窄的区带，一齐进入分离胶，然后再进行与连续凝胶电泳类似的电泳分离。3、过氧化物酶同工酶凝胶电泳过氧化物酶是植物体内的常见氧化酶。植物体内许多生理代谢过程常与其活性及其同工酶的种类有关。利用特异性颜色反应使待测酶着色，便可在凝胶中展现出酶谱。利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于含有H2O2及联苯胺的溶液中染色，出现蓝色或棕褐色部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化物酶同工酶酶谱。二、实验材料A分离胶缓冲液/100mL1mol

7、/LHCL48mLTris36gTEMED24μLpH8.9B浓缩胶缓冲液/100mL1mol/LHCL48mLTris5.9gTEMED48μLpH6.7C分离胶贮液/100mL丙烯酰胺30g亚甲基双丙烯酰胺0.8gpH8.9D（浓缩胶贮液）/100mL丙烯酰胺10g亚甲基双丙烯酰胺2.5gpH6.7E核黄素/100mL核黄素4mg F蔗糖/100mL蔗糖40g G电极缓冲液/100mL（用时稀释10倍）Tris6g甘氨酸28.8gpH8.3H封板胶（加热煮沸）琼脂粉1g电极液100mL I样品提取液

8、0.1mol/L磷酸盐缓冲液pH7.6临用时，每100mL提取液中加：蔗糖25.32g甘油16.7mL溴酚蓝0.1g J染色液2%联苯胺10mL抗坏血酸35.2mg0.6%H2O210mL水30mL K前沿指示剂0.1%溴酚蓝 L各种果蔬 白菜、萝卜、梨若干 三、实验设备1、稳流稳压电泳仪；2、冷冻离心机及离心管；3、成套电泳槽；4、微量进样器（50μL）5、高速离心机（10000r/min）6、量筒：500mL，10mL，5mL（各×1）