缺血致新生大鼠脑室周围白质软化和远期神经行为变化

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1、缺血致新生大鼠脑室周围白质软化和远期神经行为变化：胡燕，蒋犁，张敏，乔立兴【摘要】目的：建立新生大鼠脑白质损伤模型,探讨脑白质损伤后少突胶质细胞(OL)凋亡和远期神经行为的变化。方法：5日龄新生大鼠随机分为实验组和对照组，制作缺血性脑白质损伤动物模型；术后不同时间点观察生长发育,HE染色、免疫荧光标记观察脑组织病理形态改变、细胞变化,悬吊试验、旷场试验、拒俘反应测试神经行为学改变。结果：实验组生长发育明显慢于对照组,HE染色脑室周围白质疏松,侧脑室增大,髓鞘磷脂蛋白(MBP)免疫荧光标记实验组阳性细胞数较对照组明显减少(P<0.05),神经行为学检测实验

2、组大鼠神经行为能力减退。结论：成功建立5日龄新生大鼠脑白质损伤模型，显示新生大鼠脑白质损伤是以脑白质少突胶质细胞损伤为主的病变。【关键词】缺血性脑损伤；脑室周围白质软化；少突胶质细胞;新生大鼠产科和新生儿重症监护诊疗技术的发展，大大提高了早产儿的存活率，但随之而来的早产儿脑损伤也较为突出。有研究认为，早产儿脑损伤主要在白质，脑室周围白质软化(periventricularleucumalacia，PVL)是早产儿脑损伤的主要形式［1］，高发于胎龄24～32周的早产儿，发生率达26%～60%［2］。PVL可造成脑白质部位少突胶质细胞(oligodendrocyt

3、e，OL)前体的受损和丢失，致使脑白质内髓鞘不能形成，导致成活早产儿呈现痉挛性肢体瘫痪、认知障碍以及视听障碍等后遗症［3］。PVL发病机制复杂,还不完全清楚,尚须进一步研究。本研究采用双侧颈总动脉结扎法(bilateralcarotidarteryocclusion，BCAO)制作5日龄未成熟大鼠缺血性脑损伤模型，观察其脑室周围白质病理变化和远期神经行为改变情况。1材料与方法1.1材料5日龄新生SD大鼠10窝，共90只，雌雄不拘，体重8.5～11.0g，由东南大学医学院实验动物中心提供，髓鞘磷脂蛋白（MBP）单克隆抗体由上海元象医疗器械有限公司提供，山羊抗兔I

4、gG由北京中杉生物公司提供。1.2方法1.2.1动物分组90只大鼠随机分为实验组(n=48)和对照组(n=42)两组。观察5、7、14、21、28日龄大鼠生长发育情况，对29、30日龄大鼠进行神经行为学检测。1.2.2模型制作实验组：大鼠乙醚麻醉后取仰卧位于操作台上，消毒颈部皮肤，作颈腹侧正中切口约0.5cm长，分离皮下组织，找到血管神经束，分离出双侧颈总动脉，用50丝线完全结扎双侧颈总动脉后缝合皮肤，在37℃恒温水浴箱内恢复至活动正常后返回母鼠身边饲养。对照组：手术同实验组，分离双侧颈总动脉，但不结扎，缝合皮肤后回笼。手术中及术后1周内对照组大鼠死亡1只,

5、死亡率为2.4%，实验组死亡13只，死亡率27.1%，最终进入结果分析76只。1.2.3HE染色及免疫荧光检测1.2.3.1HE染色实验动物于7、14、21、30日龄(行为学测试后)行心脏灌注后断头取脑，4%多聚甲醛固定24h，取视交叉水平作石蜡切片(片厚4μm)，行常规HE染色。1.2.3.2荧光抗体标记分别于7、8、14、21日龄灌注取脑，4%多聚甲醛固定，300g·L-1蔗糖沉底后取不同冠状面作冰冻切片(10μm)，加入MBP(1∶200)4℃过夜，暗室中加入山羊抗兔IgG(1∶50)37℃孵育30min，晾干后于倒置荧光显微镜(Olympus，200倍

6、)下观察脑室周围白质部位细胞形态变化。每个标本连续作3张切片进行标记，每张切片选取5个视野（阳性细胞数最多者）计数，并取其平均值统计。1.2.4神经行为学测定动物于29日龄行悬吊试验测试肢体肌力,旷场试验、拒俘反应检测随意运动和情感行为能力，“Y”臂迷宫试验测定学习能力,30日龄时复测“Y”臂迷宫试验，检测记忆能力，如果学习训练失败，则成绩不列入统计。1.3统计学处理应用SPSS15.0进行统计学处理，两样本均数比较采用t检验，结果均以x-±s表示,P<0.05为差异有统计学意义。2.2HE染色7日龄各组大鼠大脑外观未见明显改变，实验组大鼠镜下可见脑白质

7、部位细胞水肿，细胞周围间隙增宽，脑室周围白质内大量OL呈凋亡样变化：胞浆浓缩，核质凝集，形成蓝黑色凋亡小体，个别区域有小片的坏死区，部分神经细胞胞核碎裂溶解消失,表现为坏死。但皮质、海马等部位细胞结构基本完整，未见明显的病理改变。14、21、30日龄实验组大鼠脑室周围白质较对照组明显染色浅且疏松，脑室周围白质及内囊组织相对疏松，内囊有空腔形成，脑室进行性扩大。对照组大鼠同时间点未见以上病理变化。见图1。表1两组大鼠不同日龄体重比较2.3免疫荧光标记荧光显微镜下可见MBP标记的细胞呈黄绿色荧光(图2)。7日龄实验组术后可见阳性细胞数目较对照组减少，8日龄减少最为

8、明显，与对照组相比，差异有统计学意义(