三氧化二砷对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位表达的

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1、三氧化二砷对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位表达的王南瑶，刘琳，邱少敏，赵伟，秦叔逵，陈惠英，李苏宜　［摘要］目的:研究三氧化二砷（As2O3）注射液对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位人端粒逆转录酶（hTERT）表达的影响。方法:建立人结肠癌裸鼠移植瘤模型，随机分为生理盐水组、As2O3低剂量（2.5mg・kg-1）组、As2O3高剂量（5mg・kg-1）组及5.FU（20mg・kg-1）组。腹腔注射As2O3，利用银染.端粒重复扩增（TRAP）法测定人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性、RT.PCR法检测h

2、TERT的表达。结果:生理盐水组及5.FU组端粒酶活性及其催化亚单位表达不受影响，不同剂量As2O3均明显抑制端粒酶活性及其催化亚单位表达。结论:As2O3注射液对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位的表达有抑制作用。　　［关键词］三氧化二砷;结肠肿瘤;裸鼠;端粒酶　　三氧化二砷（As2O3）注射液治疗急性早幼粒细胞白血病已取得肯定疗效。实体瘤体外实验表明，As2O3对肝癌、肠癌等多种肿瘤细胞有抑制作用［1，2］，并有临床报道As2O3治疗肝癌取得一定疗效［3］。本研究通过动物实验观察As2O3对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位人端粒逆转录酶（h

3、umantelomerasereversetranscriptases，hTERT）表达的影响，进一步探讨As2O3的抗肿瘤机制，为临床应用As2O3注射液治疗结肠癌提供实验依据。　　1材料与方法　　1.1实验动物　　实验动物为BALB.C裸小鼠，3～5周龄，雄性，体重18～22g，购自中国科学院上海实验动物中心［许可证号SCXK（沪）2003.0003］，饲养于SPF动物房。　　1.2药物及试剂　　0.1%As2O3注射液系哈尔滨伊达药业有限公司产品（国药准字H20030347）;5.FU注射液系天津金耀氨基酸有限公司产品（国药准字H12020959）。Tri

4、pur-eRNA提取试剂盒购自德国ROCHE公司;TAKARA一步法RT.PCR反应试剂盒购自大连宝森公司;银染.端粒重复扩增（TRAP）试剂自配（TaqDNA聚合酶、dNTP购于Promega公司，CHAPS、PMSF、EGTA购于Sigma公司，其他均为国产分析纯）。　　1.3移植瘤模型制备及分组　　人未分化结肠腺癌细胞株LoVo培养于含10%小牛血清的1640培养液中，在37℃、CO2体积分数为0.05的条件下培养，细胞呈单层贴壁生长，每2～3d传代1次。收集并调整细胞数为1×107ml-1。在无菌条件下裸小鼠右前肢背部皮下注射2×106（0.2ml）-1

5、的LoVo细胞，注射局部出现明显皮丘，4～6d后出现结节，移植瘤模型建立。40只裸小鼠均被制成LoVo细胞移植瘤模型，然后随机分生理盐水组、As2O3低剂量（2.5mg・kg-1）组、As2O3高剂量（5mg・kg-1）组及5.FU（20mg・kg-1）组4组，每组10只。　　1.4用药及处理　　所有裸小鼠均于接种后第7天开始腹腔注射给药，按各组所定浓度，每次0.5ml，1次・d-1，连续用药14d，停药次日处死裸鼠，解剖剥离肿瘤，取瘤组织约60mg用PBS缓冲液洗净血液后置-20℃储存，待检测端粒酶活性。

6、　　1.5端粒酶活性检测（银染.TRAP法）　　（1）端粒酶引物:Ts引物序列为5′.AATCCGTCGAGCAGACAGTT.3′，Cx引物序列为5′.CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA.3′，以上引物由上海SANGON公司合成。（2）细胞提取物制备:取手术标本60mg左右，加100μl细胞裂解液，冰浴30min，16000r・min-1离心30min，取上清液，-20℃备用。（3）TRAP反应:取1μl细胞提取液，加入TRAP反应液（含1mg・L-1Ts引物，2UTaqDNA聚合酶，5mmol・L-1d

7、NTP）。反应体积50μl，30℃保温30min。（4）PCR扩增:加Cx引物（0.1mg・ml-1）1μl进行PCR扩增，94℃30s，54℃30s，72℃30s，35个循环。（5）聚丙烯酰胺凝胶电泳:取扩增产物25μl，在12%的聚丙烯酰胺凝胶中垂直电泳（150～200V，2h），电泳结束后取下凝胶进行银染色。　　1.6hTERT.mRNA检测　　（1）hTERT引物:上游，5′.CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA.3′;下游，5′.GGATGAAGCGGAGTCTGGA.3′。GAPDH引物:上游，5′.ACGGATTTGGTCGTAT

8、TGGG.3′;下游，5