降钙素基因相关肽衍生物的优化表达及纯化

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1、降钙素基因相关肽衍生物的优化表达及纯化：肖莉杰林平陈文姜颖刘紫君于晓光【摘要】目的优化重组降钙素基因相关肽衍生物(CGRPVY)蛋白的表达体系，并利用亲和层析获得高纯度的重组蛋白。方法在前期研究的基础上，将构建的pET32a(+)rhCGRPVY在大肠埃希菌中表达，分别对时间、温度和IPTG的浓度进行优化。采用NiNTA亲和层析柱分离纯化可溶性蛋白，YLN凝胶影像分析系统和Bradford法检测纯化蛋白的纯度与含量。结果重组蛋白的最佳表达条件为诱导时间4h、诱导温度37℃、IPTG浓度0.75mmol/L，重组蛋白的最高表达量占菌体总蛋白的70%～80%，高效表达的CGR

2、PVY融合蛋白大部分可溶，纯化后蛋白纯度可达90%以上，蛋白浓度约为0.09mg/ml。结论成功优化了蛋白表达条件，并用亲和层析法纯化出大量可溶性TrxArhCGRPVY。【关键词】降钙素基因相关肽衍生物;VY;优化;纯化　　【Abstract】ObjectiveTooptimizetheexpressionlevelofengineeringstrainofcalcitoningenerelatedpeptidederivant(CGRPVY),thenuseaffinitychromatographtoobtainrebinantproteinofhighpurity

3、.MethodsBasedonthegrounderresearch,anexpressionvectorpET32a(+)rhCGRPVYizedontheinductiontime,temperature,andtheconcentrationofIPTGrespectively.ThesolublefusionproteinatographycolumnanditspurityandcontentageanalysisandBradfordassay.ResultsTheoptimizedexpressionconditionofTrxArhCGRPVYmol/LI

4、PTGoffinalconcentration.Expressionconditionsized,themaximumyieldoffusionproteinassofbacterialproteins.Thepurityreachedatleast90%andabout0.09mg/mlproteinizetheexpressionconditionofTrxArhCGRPVYinEcolisuccessfullyandobtainsolubleTrxArhCGRPVYbyaffinitychromatograph.　　【Keyization;Purification　　

5、降钙素基因相关肽(calcitoningenerelatedpeptidealpha，CGRP)是迄今所知体内较强的扩张血管的多肽成分，具有舒张血管、降低血压等生理功能，同时兼有治疗心衰和增强心输出量的作用。降血压肽(Angiotensinconvertingenzymeinhibitorypeptides，ACEIP)是一类能够降低人体血压的小分子多肽的总称，是血管紧张素转化酶(Angiotensinconvertingenzyme，ACE)的抑制剂，可通过抑制人体血管紧张素Ⅱ的生成而达到降低血压的目的〔1〕。其突出优点是对高血压患者具有降血压作用，而对血压正常的人无降压作

6、用，降压作用持久、无副作用〔2，3〕。二肽VY(ValTyr)是从清酒中提取的降血压肽，在体内具有降血压功能〔4〕，且无毒副作用。本室已成功构建CGRP衍生物(CGRPVY)的基因工程菌株，并进行了体外表达及粗提物对蟾蜍肠系膜微循环的扩血管活性检测，证实CGRPVY菌株粗提物具有扩血管活性，且活性高于CGRP的菌株粗提物〔5〕。本研究进一步探索重组质粒pET32a(+)CGRPVY在大肠埃希菌中的表达特点，以获得可溶性重组CGRPVY融合蛋白(TrxArebinanthumanCGRPVY即：TrxArhCGRPVY)的最佳表达和纯化条件，以期纯化出大量的Trx

7、ArhCGRPVY，为以CGRPVY为主要成分的降血压药物的开发性研究做必要的实验准备。　　1材料与方法　　1.1材料菌株和质粒：大肠埃希菌BL21trxB(DE3)pLysS和pET32a(+)质粒载体为Novagen公司产品。重组菌株pET32a(+)CGRPVY由哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室保存。主要试剂：异丙基βD硫代半乳糖苷酶(IPTG)等购自Promega公司，BugBusterNiNTAHis.Bind纯化试剂盒为Nov