监测细胞红蛋白在原代神经元在缺氧时的表达

《监测细胞红蛋白在原代神经元在缺氧时的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、监测细胞红蛋白在原代神经元在缺氧时的表达　　细胞红蛋白（ｃｙｔｏｇｌｏｂｉｎ）是由１９０个氨基酸组成的２１－ｋＤａ蛋白。它的三级结构具有经典的珠蛋白８个螺旋（Ａ至Ｈ），这８个螺旋折叠成三明治结构。与肌红蛋白、血红蛋白不同，细胞红蛋白是一个六配位蛋白。哺乳类动物的细胞红蛋白广泛分布于肝脏，心脏，脑，肺，视X膜，食管，肠等各个器官。在大部分器官中，它分布在纤维母细胞及间充质细胞的细胞质，而在脑神经元中，它在细胞质及细胞核中均有分布，提示着它在脑中具有某种特殊的生理功能。自２００１年发现细胞红蛋白以来，越来越多的研究结果表明它在缺氧应激状态时时扮演着保护组织、细胞的

2、重要角色。神经细胞是大脑的基本功能单位，承载着大脑的感觉，运动，记忆，思维等各种生理功能。临床上治疗ＨＩＥ时，我们最关心的是神经元的存亡，这和病人的预后有很大的关联。但迄今为止，关于细胞红蛋白在体外培养的原代神经元缺氧时表达的研究尚无。本实验通过Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ监测细胞红蛋白在原代神经元在缺氧时的表达，为研究细胞红蛋白在缺氧应激神经细胞中的调节通路提供实验基础，从而进一步为缺氧缺血性脑病中的治疗奠定基础。　　１材料和方法　　１．１　实验动物、主要试剂与仪器　孕１８ｄ的ＳＤ大鼠，由汕头大学医学院实验动物中心提供。Ｌ－ＧＬＵ－ＴＡ

3、ＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ），ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基（ＧＩＢＣＯ），Ｂ２７神经营养因子（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ），ＴＲＹＰＳＩＮ＋０．２５％ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ），ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ（ＧＩＢ－ＣＯ），多聚－Ｄ－赖氨酸（ＳＩＧＭＡ），ＲＥＡＬＴＩＭＥ－ＰＣＲ试剂盒（大连宝生物工程有限公司），即用型免疫组化试剂盒（福州迈新），烯醇化酶一抗（福州迈新）及兔抗鼠二抗（福州迈新），β－ａｃｔｉｎ一抗（武汉博士德），胞红蛋白一抗（ＳＡＮＴＡ），羊抗兔二抗（博奥森），倒置相差显微镜（日本Ｏ－ＬＹＭＰＵＳ公司），ＣＯ２培养箱（苏州净化设备），荧光定量ＰＣＲ仪（ＬＩＦＥ），

4、全能显微镜（ＬＥＩＣＡ），测氧仪（上海华光），酶标仪（Ｂｉｏ－ｒａｄ）。　　１．２　方法　　１．２．１细胞的培养冰上取孕１８ｄ的胎鼠大脑皮层，用０．０６２　５％消化后，加用含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基吹打成悬液，用台盼蓝染色进行细胞计数，以２５万／ｃｍ２种植于预先用多聚赖氨酸包被的六孔板（ＰＣＲ及免疫印迹试验用）及９６孔板内（ｃｃｋ８用），置于３７℃，５％ＣＯ２的培养箱中进行培养，４ｈ细胞贴壁后换ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ＋２％Ｂ２７＋Ｌ－ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ继续培养，每４８ｈ换液１次，培养至第６天用神经元特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）免疫组织化学方法神经细胞进

5、行纯度鉴定。　　１．２．２神经元纯度鉴定吸净培养基，用２％多聚甲醛固定，甲醇双氧水浸泡，加山羊血清封闭，加一抗（对照组用ｐｂｓ代替），置４°冰箱过夜。第２天ＰＢＳ浸洗后，加二抗３０ｍｉｎ，加辣根过氧化物酶６０ｍｉｎ，ＰＢＳ浸洗后，滴加ＤＡＢ显色约５ｍｉｎ（显微镜下观察显色情况），ＰＢＳ冲洗，晾干，树胶封片。显微镜下随机选取１０个视野计数。　　１．２．３细胞缺氧。实验前将培养基５％ＣＯ２和９５％Ｎ２的气体中过夜。实验时，将细胞随机分为４组，其中１组作为正常组（０ｈ），其余３组培养基换为预缺氧的培养基，然后充入５％ＣＯ２和９５％Ｎ２的气体的真空袋中，分别缺

6、氧８ｈ，１６ｈ，２４ｈ，缺氧后用测氧仪监测气体的氧浓度，氧气浓度在０～０．９％之间的进行下一步实验。　　１．２．４荧光定量。ＰＣＲ用Ｔｒｉｚｏｌ（Ｔａｋａｒａ）、氯仿、异丙醇、７５％乙醇裂解细胞分离沉淀ｍＲＮＡ，适当的ＤＥＰＣ水溶解ｍＲＮＡ，紫外分光光度计测定ＲＮＡ浓度和ＯＤ值（１．８～２．１），在逆转录酶作用下，将ｍＲＮＡ逆转录成ｃＤＮＡ。采用荧光染色技术进行实时定量多聚酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅ－ａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ），获取各组标本标准曲线，计算机分析Ｃｔ值。７３００系统的ＰＣＲ的反应条件：第一阶段９５℃３０ｓ；第二阶段９５℃３ｓ，６

7、０℃３１ｓ，４０个循环；第三阶段９５℃１５ｓ，６０℃１ｍｉｎ　９５℃１５ｓ，ＰＣＲ引物设计如下。ＣＹＧＢ基因，引物为５＇－ＣＣＴＧＧＴＧＡＧ－ＧＴＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣ－３＇（上游），５＇－ＣＡＧＡＡＴＧＡＣ－ＣＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣ－３＇（下游）。β－ａｃｔｉｎ（内参）基因，引物为５＇－ＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＧ－３＇（上游），５＇－ＴＡＣＧＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＡＣＡＧ－３＇（下游）。　　１．２．５免疫印迹试验加５０μＬ／孔单去污剂裂解液（含ＰＭＳＦ１００∶１）于六孔板内，超声波震荡，置冰上裂解３０ｍｉｎ后，移至１．５ｍＬ离心

8、管中，４℃下１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心