高效液相色谱法测定不同产地的夏枯草中熊果酸含量

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1、高效液相色谱法测定不同产地的夏枯草中熊果酸含量孙乙铭，徐建中，王志安，俞旭平【摘要】　　目的建立夏枯草的高效液相色谱法（HPLC）的分析方法，研究不同产地夏枯草中熊果酸的含量差异。方法色谱柱为迪马钻石DiamonsilC18分析柱(4．6mm×250mm×5μm)；流动相为0．04mol／L磷酸二氢钠∶乙腈(体积比为20∶80)；检测波长210nm；柱温35℃。结果不同产地资源的夏枯草药材中熊果酸含量有明显的差异,其中以四川峨眉产的夏枯草中熊果酸含量最高，其次为浙江磐安产的。结论该结果可为评价不同产地夏枯草

2、药材质量，为选育出夏枯草的优良品种提供依据。【关键词】高效液相色谱夏枯草熊果酸　　夏枯草为唇形科植物夏枯草PrunellavulgarisL．的干燥果穗。味苦、辛寒，有清火、明目、散结、消肿等功效〔1〕。夏枯草主要含有三萜及其苷类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素、有机酸、挥发油及糖类等成分。具有降压、降糖、抗菌、抗炎、抗过敏及抗病毒等作用〔2，3〕，在我国主产于湖南、安徽、浙江、江苏。本实验采用HPLC法同时测定不同产地夏枯草中熊果酸含量，通过比较不同产地夏枯草的质量，为合理利用该药用植物资源及评价不同产地夏

3、枯草的质量提供依据。　　1仪器与试药　　AglientHP1100高效液相色谱仪(安捷伦)，二极管阵列检测器(DAD)；熊果酸对照品购自中国药品生物制品检定所，乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。夏枯草药材分别从浙江景宁、浙江磐安、四川南充、四川峨眉、浙江乐清、重庆彭水、重庆南川采集或收集，经鉴定为唇形科植物夏枯草的干燥果穗。　　2方法与结果　　2.1色谱条件色谱柱为迪马钻石DiamonsilC18分析柱(4．6mm×250mm×5μm)；流动相为0.04mol/L磷酸二氢钠（用5%磷酸调节pH至

4、2.80）∶乙腈(体积比为20∶80)；流速1.0ml/min；检测波长210nm；柱温35℃；进样量20μl。　　2.2样品液的制备　　2.2.1标准溶液的配制称取熊果酸标准样品2.57mg，置于25ml容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得含熊果酸0.1028mg／ml的标准溶液。　　2.2.2供试品溶液的制备称取样品粉末（过2号筛）2g，精密称定，置索氏提取器中，加入乙醚50ml，浸泡过夜，加热回流6h，蒸干溶剂，残渣用甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度。精密量取1ml，置10ml量瓶中，用甲醇

5、稀释至刻度，摇匀，即得。　　2.3方法学考察　　2.3.1线性关系考察精密吸取该对照品溶液2，5，10，15，20，25，30，40μl，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，熊果酸进样量为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程：Y=542.6263X-7.2143，相关系数r=0.99998。表明熊果酸在0.2～40μg范围内具有良好的线性关系。　　2.3.2精密度实验精密吸取熊果酸对照品溶液，重复进样5次，20μl,考察测定的精密度，熊果酸峰面积积分值分别为1096.6，1092.8，1089.9，

6、1107.5，1100.1。平均值为1097.38，相对标准偏差为0.62％。　　2.3.3重复性实验取同一批号的夏枯草6份，依上述条件测定含量，样品熊果酸含量分别为2.5197%，2.4896%，2.7047%，2.6595%，2.6678%，2.6132%，相对标准偏差为3.32%，表明方法的重复性较好。　　2.3.4稳定性实验取同一标准品溶液，室温下放置，分别在0，24h进样20μl测定，熊果酸峰面积积分平均值分别为1095.9，1097.4。表明样品溶液在室温下比较稳定。　　2.3.5加样回收率实验

7、取已知含量的夏枯草样品，分别添加熊果酸对照品后，同上述条件，进行测定。结果见表1。　　表1加样回收率实验结果（略）　　2.3.6样品测定按上述条件测定所采集自浙江、重庆、四川等地的夏枯草样品中熊果酸含量。结果见图1～2及表2。　　图1对照品HPLC图（略）　　图2样品HPLC图（略）　　3讨论　　3.1提取条件的选择实验中以熊果酸的含量作为考察指标，筛选并确定最佳提取方法，比较不同提取溶剂（甲醇、乙醇、乙醚）索氏提取、不同提取时间（2，4，6，8h）对熊果酸含量的影响。结果表明，以乙醚为溶剂提取效果最好，6

8、h已基本提取完全，故采用乙醚索氏提取6h。　　表2不同产地夏枯草中的熊果酸含量（略）　　3.2流动相的选择曾考察了用甲醇作流动相，但熊果酸峰与杂质峰不能分离，所以改作乙腈作流动相。曾用不同比例的乙腈与水作流动相，但峰形不佳，可能是熊果酸有部分解离的缘故。所以改用0．04mol/L磷酸氢二钠，用5%磷酸调pH值，用pH值分别为2.6，2.7，2.8和2.9等4种缓冲盐溶液，在pH2.6和2.7两种条件下，表现为基线