乙型肝炎病毒核苷（酸）类似物耐药的检测

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1、乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的监测缪晓辉2009.5一、HBV耐药的有关定义二、各种耐药检测技术的评价三、需要重视的几个问题一、HBV耐药的有关定义病毒学突破（virologicbreakthrough）病毒反跳（viralrebound）生化学突破（biochemicalbreakthrough）HBV基因型耐药（genotypicresistance）HBV表型耐药（phenotypicresistance）临床耐药（clinicalresistance）HBV耐药的有关定义病毒学突破（virologicbreakthrough）指在核苷类药物治疗

2、过程中，患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBVDNA水平与最低值相比上升或超过1个log10（10倍）。HBV耐药的有关定义病毒反跳（viralrebound）指核苷类药物治疗过程中患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBVDNA升高至＞2×104IU/mL或高于治疗前水平。HBV耐药的有关定义生化学突破（biochemicalbreakthrough）指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平一度复常，但在继续治疗中血清ALT水平又再次升高。肝脏生活指标很多，但是在此仅指ALT。HBV耐药的有关

3、定义HBV基因型耐药（genotypicresistance）指HBV基因组中的某些位点发生改变，导致这种药物对HBV的抑制作用下降或消失。这种HBV基因变异与HBV的耐药性有直接因果关系，通过这些变异位点的检测可判断HBV有无耐药性。HBV耐药的有关定义HBV表型耐药（phenotypicresistance）通过体外细胞培养方法，直接测定HBV对某种药物的敏感性，或者在体外直接测定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药，即表型耐药。通常以IC50来评估IC50＜5倍:敏感IC50在5～10倍:部分耐药IC50＞10倍:耐药HBV耐药

4、的有关定义临床耐药（clinicalresistance）指临床出现病毒复制不能被抑制，或HBV复制一度被抑制后又出现HBVDNA反跳，同时伴有ALT升高，或肝炎复发的其他临床证据。二、各种耐药检测技术及评价病毒学反跳或突破的监测HBV基因型耐药监测HBV表型耐药检测临床耐药监测病毒学反跳或突破的监测基于对血清HBVDNA载量的动态监测需重视以下三点：1.HBVDNA载量检测手段的敏感性2.检测技术的可靠性和稳定性3.监测的间隔时间HBV基因型耐药监测时机非必须不主张常规、广泛应用基因型耐药相关变异的命名基因型耐药相关变异在HBV多聚酶序列中的位置HBV

5、基因型耐药的主要技术碱基序列分析法直接测序克隆测序聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)反向杂交分析技术（INNO—LiPA）基因芯片技术实时荧光定量PCR技术探针定点突变PCR技术引物末端碱基定点突变扩增技术熔解曲线法基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)直接测序法末端终止法化学裂解法DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各

6、种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。优点简便、迅速、应用广泛。不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。①简便、快速、准确可靠。②安全、无放射性污染。③模板用量大大减少。④测序能力增强。HBVYMDD变异直接测序结果图谱直接DNA测序的局限性1.设备贵、技术高、耗材、费时。2.必须有充足目的基因片段。3.突变株比例小于20%时，由于竞争抑制作用不能被扩增。直接测序法检测HBVYMDD变异1.JPG克隆测序法克隆测序法优点：1.有助于发现混合株并可大致确定不同序列毒株之间的相对比。2.提高了

7、检测的灵敏度。局限性：1.技术难度较高。2.检测周期更长。3.检测的费用大大增加。碱基变异可能导致：①原有位点消失②产生新的位点③识别位点移位利用错配引物使PCR产物中产生特异的酶切位点结果:酶切片段长、短变化和多、少变化聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)限制性内切核酸酶的作用它们能识别DNA的特异序列，并在识别序列内或其旁切割双链DNA。如：NdeI限制酶的识别序列和切割位点：---CATATG------GTATAC---NlaIll限制酶的识别序列和切割位点：---CATGNNN------GTACNNN---PCR-RFL

8、P检测HBVYMDD变异PCR错配引物设计PCR-RFLP检测HB