病毒感染的实验诊断课件

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1、病毒感染的实验诊断张德纯教授临床微生物教研室病毒（Virus）是结构最简单、体积最小的微生物。病毒感染十分常见，约70%~80%的传染病由病毒感染所引起。迄今已证实500多种病毒对人有致病性，其中不少病毒危害极大，如最近流行的SARS病毒。因此尽快获得病毒的实验诊断，对控制病毒的传播、疾病的诊断和防治具有重要的意义。病毒性疾病实验诊断的一般原则：特异、敏感、快速和简便。首先根据流行病学和临床特点，初步判断可能感染的病毒；然后根据可疑病毒生物学特点、机体免疫应答和临床过程，以及病人当前所处的时机，

2、确定实验诊断的方法。目前病毒感染的检查主要依靠经典的方法和近来发展起来的分子生物学等方法。前者主要包括病毒分离培养、鉴定及血清学实验；后者主要是核酸杂交与PCR及现代免疫学技术。病毒学检验病毒分离培养病原学诊断形态学检测分子生物学技术——病毒核酸补体结合试验中和试验血清学诊断血凝抑制试验间接免疫荧光检测酶联免疫吸附试验一、标本采集与运送（一）标本的采集要从临床标本中成功地分离出病毒，很大程度上取决于标本的恰当采样和处理，为了保证标本质量，应注意以下问题：1．采样时间尽可能在发病的初期，急性期或患

3、者入院的当天进行，越早越好，最好在治疗之前。疾病后期体内产生免疫力，病毒量减少或消失。2．标本种类的选择根据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感染病毒的种类，选择相应部位采取标本，处理标本时要考虑病毒的生物学特性。常见分离病毒标本的选择见教材P64表4-2。（1）心脏疾病（2）中枢神经系统感染（3）先天或新生儿感染（4）胃肠道疾病（5）呼吸道感染3．常见标本的采集方法（1）血液：以无菌手续抽取抗凝血10ml，抗凝剂可选用100u/ml肝素钠。为了血清学检查的需要，应抽取另一管5ml血液，不抗

4、凝送检。（2）脑脊液：以无菌手续抽取脑脊液1~2ml，置无菌试管内，在冰浴中立即送检。4℃可存放72h。（3）宫颈或阴道拭子采取病灶部位分泌物，将拭子置运送液中；如无病损部位，则清理宫颈口粘液，将拭子伸入宫颈约1cm停留5秒以上取出，置运送液中4℃冰浴立即送检。（4）粪便标本取2~4g粪便标本在无菌的容器中，加8~10ml运送液立即送检。（5）含漱液可用无菌生理盐水，让患者含漱几次取得，与运送液等量混合。（6）喉拭子：用生理盐水湿润的拭子采取咽喉部表面，置运送液中，注意避免唾液污染。（7）尿道拭

5、子及尿液标本：尿道拭子伸入尿道4cm轻轻转动2~3次，以获得较多的上皮细胞，取出后置运送液中。（8）尸检标本：应在死亡后尽早采取，采集各种器官时要分开使用器械和容器。（二）标本的运送和保存标本采集后注意无菌、冷冻、保湿、立即送检。分离培养病毒的标本要尽快送到实验室处理和接种。如不能及时送检，可在4℃冷藏数小时，如需较长时间保存则应置-70℃。放置在-20℃，病毒容易灭活，冻存液中需加入甘油或二甲亚砜等作保护，避免反复冻融使病毒灭活。为了抑制细菌生长通常在病毒传送培养基（VTM）中加入抗生素如青霉

6、素100U/l和链霉素100μg/ml，为了抑制真菌的生长加入2.5μg/ml二性霉素B或40μg/ml制霉菌素。二、病毒的分离与鉴定（一）病毒分离和鉴定的一般程序见书P66图4-1（二）病毒的分离病毒是专性细胞寄生，需要在活细胞或动物体内才能得到分离。选择何种动物或细胞来分离，应根据临床感染的症状和流行病学资料，推测可能的病毒种类，选择相对敏感的动物和细胞来分离标本中的病毒。1.组织培养（1）概念将人或动物离体的活组织或分散的活细胞，在实验室的试管或培养基中，模拟体内的生理条件使之生存和生长，

7、称之为组织培养。（2）组织培养的类型A器官培养：如气管、肠段。器官保存了原功能，用于分离某些有器官特异性的病毒。B组织块培养：如肝组织块培养肝炎病毒。C细胞培养（单层细胞培养）：现广泛使用的组织培养技术。（3）细胞培养的种类和方法根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不同可分为三类：1．原代和次代细胞培养离体的新鲜组织或器官，机械处理胰蛋白洗涤吹打酶消化加入营养液单个细胞悬液1-3次细胞计数、调整细胞浓度分装在培养生长瓶内培养形成单层细胞，称为原代细胞培养胰酶消化转种新的培养瓶形成单层细胞，称为

8、次代细胞培养2．二倍体细胞株原代细胞多次连续传代后仍保持二倍体染色体特性（即含23对染色体），称之为二倍体细胞。传代细胞寿命一般为40~50代，大多数为成纤维细胞,如人胚肺细胞。广泛用于病毒分离和疫苗制备。3．传代细胞系来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程的变异细胞。细胞增殖特征和染色体均类似于肿瘤细胞。不宜用于疫苗的制备，常用于病毒的分离和鉴定。（4）组织培养的特点优点：A．来源广；B．不受机体免疫因素影响，个体差异小，敏感范围广；C．易于观察病变；D．可用于病毒的分离、鉴定、疫苗的制备；E．易管理