病毒感染的实验室诊断PPT课件

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1、病毒感染的实验室诊断1病毒感染——实验室确诊的意义2003年SARS爆发2008年手足口病的流行群体性发热临床工作中病原的确定及时准确的实验室确诊非常重要23Dengue登革热麻疹可疑病例的临床诊断发热＞38OC，出现斑丘疹和至少伴有以下一种症状：咳嗽，鼻炎或结膜炎（WHO）EchovirusesEcho病毒Measles麻疹ParvovirusB19微小病毒B19HHV-6Rubella风疹Others其它4内容病毒感染的实验室诊断方法简介检测的结果分析EBV感染的血清学诊断5病毒感染的诊断方法简介6病毒感染的诊断类型及方法类型方法所需标本临床

2、意义抗体检测（IgG/IgM)ELISA,IF,EIA血清，CSF是否感染和感染的大概时期抗原检测（蛋白质）ELISA,IF,EIA咽拭子，粪便,血细胞图片，活动性感染病毒核酸（DNA/RNA）PCR体液和咽拭子感染病毒分离细胞培养体液，咽拭子及组织金标准，产毒性感染7细胞免疫体液免疫核酸检测/病毒分离抗原检测抗体检测潜伏期症状期恢复期临床表现康复或死亡病毒感染的临床过程与诊断8ELISA的原理病毒抗原/抗体包被在固相载体表面加入待检血清，→抗原抗-体复合物洗涤，加入酶标记抗人免疫球蛋白，与抗原抗体复合物特异性结合洗涤，加入底物显色，测OD值91

3、0ELISA结果的判定目测法：一般加底物后，肉眼下出现颜色的为阳性，无色为阴性临界值法：以标本OD值＞阴性对照平均OD值加2-3个标准差作为阳性结果的阈值S/N值法：以S/N值≥2.1为阳性，S/N值＜2.1而≥1.5为可疑，S/N值＜1.5为阴性11免疫荧光法间接法和直接法间接法1）固定2）冲洗3）与第一抗体结合4）与第二抗体及免疫荧光抗体结合5）冲洗6）封片、观察12DEAFFtestforCMV(VirologyLaboratory,Yale-NewHavenHospital)13PCR一、PCR基本原理PCR是一种快速和简便的DNA体外扩

4、增技术。在模板DNA，引物和4种脱氧核糖核苷三磷酸存在的条件下，利用耐热DNA聚合酶进行聚合反应，经变性、退火及延伸三步骤多次循环，对特定DNA模板进行扩增。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。14PCR的要求目的基因的序列设定引物PCR实验要求的原料：引物、酶、dNTP、Mg+、模板及缓冲液15PCR一次循环包括三个基本步骤：1.变性(denaturation)：加热至90~96ºC，DNA双链模板变成单链2.退火(annealling):缓慢降温至30-65ºC，引物与单链DNA模板互补结合3.延伸(extention):升

5、温至70~74ºC,DNA链延伸（需TaqDNA聚合酶，dNTP，Mg2+）循环30次，特异DNA产量达230拷贝(约109)PCR基本步骤16PCR扩增靶DNA示意图双链靶DNA变性退火延伸5’3’5’3’5’5’3’3’17第二次循环18n次循环靶DNA，(2n-2n)个拷贝第三次循环靶DNA靶DNA19PCR反应步骤预变性退火延伸变性20PCRanimation21常规PCR产物确认22荧光定量PCR23荧光定量PCR的标准曲线24病毒分离标本接种于敏感细胞观察细胞病变病毒的鉴定：PCR，IF等25CytopathicEffectCytop

6、athiceffectofenterovirus71andHSVincellculture:notetheballooningofcells.(VirologyLaboratory,Yale-NewHavenHospital,LindaStannard,UniversityofCapeTown)26检测结果的分析27一、血清中特异性IgG和IgM的意义单份血清特异性IgG阳性，只能说明过去有过病毒感染，而不能确定最近感染。只有在发病初期检测不到抗体或滴度低，而恢复期抗体4倍以上升高才有诊断意义。测定单份血清中的特异性IgM抗体，有助于疾病的早期快

7、速诊断，但临床诊断中要结合病程、临床表现和病毒类型综合考虑。28TypicalSerologicalProfileAfterAcuteInfectionNotethatduringreinfection,IgMmaybeabsentorpresentatalowleveltransiently29检测IgM应注意的问题持续的IgM反应：如风疹、CMV等早期妊娠感染或先天性感染的儿童，特异性IgM可能持续达1年或更长时间IgM型抗体阴性：1）病程：风疹、出疹后第1天，45%能查到IgM；麻疹、出疹后3天内，70%左右能查到IgM2）病人的免疫功能：

8、免疫抑制病人303）局部感染4）隐性感染的再激活和再次感染（EBV、CMV等人疱疹病毒）：产生的特异性的IgM少，应查双份血清的特异性I