医学课件黄酮及金属离子对葡萄糖苷酶的抑制作用研究

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1、更多医学精品尽在医学吧http://www.docin.com/rayshiu化学生物学综合实验六指导教师：马林化学与化学工程学院黄酮及金属离子对-葡萄糖苷酶的抑制作用研究一、实验基本原理-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)是一类能够从含有-葡萄糖苷键底物的非还原端催化水解-葡萄糖基的酶的总称，包括麦芽糖酶、异麦芽糖酶、蔗糖酶等，又叫-D-葡萄糖苷水解酶。位于小肠绒毛粘膜细胞刷状缘的-葡萄糖苷酶在机体的代谢过程中起着十分关键的作用，参与了人体对摄入的淀粉和蔗糖等碳水化合物的消化吸收、糖蛋白和糖脂的加工，与许多因代谢紊乱失调而引起的疾病、神经细胞的分化、肿瘤的转移以及病

2、毒和细菌的感染有密切关系。另外在生物体内，大多数蛋白质都是以糖蛋白形式存在，它们包括酶、免疫球蛋白、载体蛋白、激素、毒素、凝集素和结构蛋白，涉及到细胞识别、信息传递、激素调节、受精、发生、发育、分化、神经系统和免疫系统恒态维持等各个方面的功能。许多疾病的发生和发展，如炎症及自身免疫疾病、老化、癌细胞异常增殖及转移、病原体感染等都与糖蛋白寡糖链的变化密切相关。α-葡萄糖苷酶抑制剂因此，通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以达到治疗某些疾病的目的，研究最为成熟的是治疗Ⅱ型糖尿病的口服降糖药物。其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖

3、的吸收，降低餐后高血糖。同样也可以针对糖链的变化，利用小分子化合物抑制糖苷转移酶和糖苷酶的催化活性，可以控制糖链的合成和水解，从而达到治疗疾病的目的。因此，能够阻断寡糖链生物合成的α-葡萄糖苷酶抑制剂，也被用作抗病毒和抗肿瘤的药物。目前临床使用的α-葡萄糖苷酶抑制剂具有降血糖作用的α-葡萄糖苷酶抑制剂具有抗病毒作用的α-葡萄糖苷酶抑制剂二、实验过程酶抑制剂的高通量筛选可以通过酶标仪进行，但系统地、准确地研究抑制剂的IC50以及抑制作用的动力学必须通过精密仪器进行检测。本实验将利用紫外-可见分光光度计测试几种化合物对酵母-葡萄糖苷酶的抑制作用以及协同抑制作用。实验材料：酵母-葡萄糖苷酶

4、（Sigma公司）。抑制剂：槲皮素、染料木素、葡萄糖、果糖、硫酸铜、氯化锌。底物：对硝基苯酚葡萄糖苷（pNPG，Sigma公司）实验仪器和条件北京普析通用UV-1901紫外可见分光光度计实验条件：缓冲液：0.01mol/LpH6.8或7.0磷酸盐缓冲液。底物：3mg/mL对硝基苯酚葡萄糖苷；化合物溶液的配制：槲皮素、染料木素用DMSO配成50mol/L。葡萄糖、果糖用水配成100mol/L。氯化锌和硫酸铜用蒸馏水配成50mol/L。实验安排1，酶催化条件探索由于每次实验得到的酶催化活性不同，所以每次在测试过程中，需要探索实验中所使用的酶的剂量。本实验要求测试的酶催化活性-每分钟OD

5、值变化在0.1-0.13范围内。本实验采用调节酶液用量或增加底物用量的方式。2，测试体系在总计1000L的测试体系中，加入920或930L0.01mol/LpH6.8磷酸盐缓冲液，10L样品溶液（以10L缓冲液或DMSO做对照），10-20L酶液，室温放置20分钟，立即加入20-50L3mg/mL对硝基苯酚葡萄糖苷溶液，400nm进行时间扫描，记录1分钟的OD值.实验安排3，抑制剂IC50的测试改变样品溶液的剂量，分别测试酶催化活性。可以通过稀释的方式改变样品的浓度。以没有加入样品的酶催化活性OD/min值为100%，用抑制百分数(指被抑制而失去活力的百分数)表示不同浓度样品

6、对酶的抑制活性，作图求出抑制50%时样品的浓度。实验安排4，抑制剂动力学的测试适当选择2个不同的样品浓度，以及没加样品三个系列，改变底物溶液的剂量，分别测试酶催化活性。以底物浓度（mol/L）倒数1/[S]对酶催化活性OD/min值的倒数1/V作图，根据三条线的交点判断抑制剂的类型。协同抑制作用研究酶是生物体内重要的生物大分子，有着特殊的催化功能，与许多疾病的产生和发展都有着密切联系，是药物开发设计的一个常见的靶点。而且，酶除了其活性中心可以与专一的底物互相结合外，其他的部位也可以与不同的物质结合，使酶的活性发生改变。因此，我们可以设想用不用抑制类型的抑制剂同时对酶进行抑制，产生协同抑

7、制的效果，令酶的活性比使用单一抑制剂时更低的同时，也可以减少抑制剂的用量，产生1+1>2的效果。由于-葡萄糖苷酶有多个性质不同的抑制位点，因此我们可以推测，利用不同类型的抑制剂(竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂以及金属离子)可以起到协同抑制的效果。实验安排5，协同抑制作用的测试通过稀释的方式分别改变槲皮素、果糖、锌离子样品溶液的浓度、剂量，测试两种或三种样品对酶的抑制催化活性。将两种或三种化合物单独测出的抑制活性相加，得出加合后的抑制