实验八、培养基配制与灭菌

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1、实验八、培养基的配制与灭菌目的要求了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。实验材料药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O等。高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌灯。其它：天平、牛角匙、电炉、1NHCl、1NNaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌

2、试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等。方法与步骤培养基的配制分离培养微生物常用器皿的准备培养基和玻璃器材的灭菌方法培养基的配制方法和步骤称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。调pH值：用1NNaOH或1NHCl调pH，用pH试纸对照。加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。分装：注意不要污染棉塞。包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可

3、使用。方法与步骤（培养基的配制方法和步骤）方法与步骤（培养基的配制方法和步骤）方法与步骤（几种培养基的配方及配制）牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）配方如下：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化钠5g琼脂20g自来水1000mLpH7.2~7.4灭菌1.05kg/cm2，20min淀粉琼脂培养基（高氏一号Gause´1），用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方如下：可溶性淀粉20.0gKNO31.0gK2HPO40.5gMgSO4•7H2O0.5gNaCl0.5gFeSO4•7H2O0.01g

4、琼脂20g自来水1000mL灭菌：1.05kg/cm230min马铃薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）琼脂培养基（用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基），其配方如下：去皮马铃薯（或鲜豆芽）200g蔗糖（或葡萄糖）20g自来水1000mL琼脂20gpH自然灭菌：（含蔗糖）1.05kg/cm220min（含葡萄糖）0.1kg/cm230minYPD培养基（分离培养酵母菌）YPD或YPED，：YeastExtractPeptoneDextroseMedium(1L)，酵母膏蛋白胨葡萄糖培养基：配方：1%YeastExtr

5、act（酵母膏），2%Peptone（蛋白胨），2%Dextrose(glucose)（葡萄糖），若制固体培养基，加入2%琼脂粉。无菌水的制备无菌水为下一次微生物分离实验中所需要的材料。100mL三角烧瓶（装有玻璃珠），装自来水99.0mL，试管中装4.5mL自来水，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。三角烧瓶和试管须预先塞好棉塞，并灭菌。方法与步骤（分离培养微生物常用器皿的准备）清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等。棉塞的制作包装培养皿和吸管等。四、注意事项称药品用的牛角匙不要混用；称完药品应及时盖紧瓶盖。调p

6、H时要小心操作，避免回调，不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。五、实验报告记录本实验配制培养第的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。思考题固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培养基进行无菌检查？采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称之为灭菌。灭菌是要进行微生物纯培养的需要。实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌效果。高温主要

7、是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子发生变性。高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。湿热灭菌的效果比优于干热灭菌。湿热下热量易于传递，更容易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，加速其变性。此外，过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药物灭菌和消毒等也是微生物学操作中不可缺少的常用方法。消毒和灭菌三、操作步骤(—)高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌。1．加水将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相平为至。2．装料将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培养基的容器放置时要

8、防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞。3．加盖将盖上与排气孔相连接的排气软管插人内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开排气阀；4．排气加热．待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出。一般认为，当水沸后约5min，表明锅内空气已排净。5．升压当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，