实验一培养基的配制与灭菌.doc

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1、实验培养基的配制与灭菌■■■一、目的学习并掌握培养基配制及灭菌的方法二、原理（一）培养基在植物组织培养过程中，外植体生长所必需的营养成分和生长因子，主要由培养基提供不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基，对组织培养取得成功是至关重要的。培养基通常包括下列成分（表1）表1培养基的组成成分及其作用类别成分作用无机物大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S微量元素：Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、I、Co等植物生长必需的营养元素有机物营养物：糖类、氨基酸及酰胺类生理活性物：维生素等为植物细胞提供C、H、O、N等必要元素作为生理活性物质在细胞代谢中起一

2、定作用植物生长调节剂植物天然的一五类激素及其人工合成的类似物作为生理活性物质参与植物生长发育的调节附加物如琼脂、活性成等有利于植物细胞生长其他未知复合成分如椰子汁、酵母提取物、香蕉、西瓜水、马蹄汁等供给一些必要的微量营养成分、生理活性物和生长激素等配制培养基可以直.接称量，但为了减少称量麻烦和提高称量的准确性，通常都按配方浓度的若干倍称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，用时按比例稀释。-•般要配下列母液:1、微量元素母液：除铁盐外的其它微量元素盐类的混合液，通常配成1000X2、有机化合物母液：通常配成100X3、铁盐母液：铁盐与其它无机物成分混合易沉淀，须单独

3、配制。浓度为1000X4、激素母液：各种激素单独配制成母液，浓度从O.Img到l.Omg/ml不等。5、1OX大量元素母液：培养基除激素、糖、琼脂外，其他成分混含配成10倍液，分装后置于冰箱冷冻格保存。用时取适量该母液，加入激素、糖、琼脂、水等配成常用培养基。（二）培养基的灭菌：培养必须保证绝对无菌，否则因其营养丰富，细菌、真菌极易滋生，而导致外植体死亡。灭菌方法下列几神：1.高温高压灭菌法：将培养基放入高压锅内，在121°C>108KPa（1.1kg/cm2）fKj压力下持续约20分钟。1.过滤除菌法：带菌的溶液通过孔径为0.22Mm（或更小）的微孔过滤器装置后

4、，杂菌阻隔留在滤膜上，而溶液进入无菌空瓶内，从而达到除菌的目的。此法用于不能以高温高压火菌的培养液或酶液的除菌。2.^Coy射线法：用Y射线过量照射以灭菌。可用于大量灭菌，但设备昂贵。三、仪器设备及用具（-）仪器设备万分之一电子天平百分之一电子天平超净工作台高压锅酸度计磁力搅拌器及搅拌了不锈钢过滤器玻璃蒸饲水器家用冰箱（二）用具烧杯：100mlXL500mlX1；量筒：100mlXl,250mlX1磨口试剂瓶:100mlX1,500mlX1；带盖试剂瓶:500mlX2三角瓶：100mix1,250mlxi药匙、称量纸、牛皮纸、棉花塞、橡筋：若干（三）试剂1NHCL

5、02NKOH蔗糖（分析纯）琼脂粉N6大量：KNO3CaCl2-2H2OMgSO4-7H2OKH2PO4（NH4）2SO4B5微量：KIH3BO3MnO4-H2OZnSO4-7H2ONa2MoO4-2H2OCuSO4-5H2OCoCLo-6H2ONa2EDTAFeSO4-7H2OB5有机：盐酸硫胺素盐酸II比哆醇烟酸肌醇谷氨酰胺水解酪蛋白脯氨酸2、4-D6-BANAA五、实验步骤（一）配母液1、B5微量元素母液（1000X/100ml）：按配方的1000倍用万分之一天平依次称量，搅拌溶解（溶解一种后再加另一种）后定容。用量极少的成分（如CuSO4-5H2O.CoCL

6、2-6H2O>Na2MoO4-2HQ）即使按1000倍称量仍很困难。2、M大量元素母液（10X）、Bs有机成分母液（100X）：配法同1。3、2,4-D母液（0.5mg/ml）：用万分之一天平称取2,4-D50mg一用少量95%乙醇溶解一加水定溶为lOOmL4、6-BA母液用万分之一天平称取6-BA100mg-*用少量IN盐酸溶解一加水定溶为lOOmL5、NAA母液（lmg/mI）：用万分之一天平称取NAAlOOrng一用少量95%乙醇溶解一加水定溶为100ml.6、铁盐母液(1000X/1000ml)：用百分之一天平称取FeSO4-7H2O27.8g,Na2ED

7、TA37.3g—分别置于10()0ml和50()ml烧怀，各加水500ml-加热搅拌，充分溶解一趁热混合，冷却装瓶。以上各母液配好后分别装入磨口试剂瓶，贴上标签，写明名称、浓度和配制日期，置于4°C冰箱保存。(%1)配NB诱导、分化培养基1、诱导培养基(本次配置)N6大量+B5微量+B5有机+30g/L蔗糖+500mg/L谷氛酰胺+500mg/L脯氛酸+300mg/L水解酪蛋白+2mg/L2,4-D+8.0g/L琼脂粉pH5.82、分化培养基(本次实验3周后再配置)N6大量+B5微量+B5有机+30g/L蔗糖+5(X)mg/L谷氛酰胺+50()mg/L肺氛酸+1.

8、25mg/