实验一培养基的配制与灭菌、消毒技术.doc

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1、生物化学与分子生物学实验指导书天津理工大学环境科学与安全工程学院2006.7目录实验一蛋白质的变性凝固及沉淀反应实验二豚酶Km值简易测定4实验三谷物种子中赖氨酸含量测定6实验四蛋白质的颜色反应（米伦氏反应）8实验五蛋白质含量测定（双缩豚法）9实验六酶动力学因子对酶活力的影响（综合实验）10实验七碱裂解法制备质粒DNA13实验八水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA15实验九紫外吸收检测DNA的浓度和纯度17实验一蛋白质的变性凝固及沉淀反应一、目的要求1熟悉蛋白质的沉淀反应。2进一步掌握蛋白质的有关性质。二、基本原理蛋白质受热作用后

2、，其分子内部结构发生变化，常使疏水基暴露于表面，因而失去原有的亲水性质，成为溶解度很低的变性蛋白。蛋白质在其等电点或等电点附近受热作用，则凝固而沉淀。若在稀酸稀碱中加热，由于变性蛋白质带正电荷或负电荷，故不易析岀，此时如调节到等电点或等电点附近则沉淀析出，称为结絮。结絮的变性蛋白尚可溶于稀酸或稀碱中。结絮蛋白继续加热,则成较大的块状凝固蛋白，些时即不再溶于稀酸或稀碱中。蛋白质由于水化层和电荷的存在，因此其水溶液具有亲水胶体的性质。凡能破坏蛋白质水化层和电荷存在的因素，均可使蛋白质从溶液中沉淀出来，这种蛋白质由溶液中析出的现象

3、称为蛋白质的沉淀反应。大多数蛋白质经盐析反应，或在低温下用乙醇或丙酮短时间作用使蛋H质沉淀后，除去上述因素，蛋白质又能溶于原来的溶液中，属于可逆的沉淀反应。但用重金属盐类、生物碱试剂、加酸及加热引起的蛋白质沉淀反应一般均属于不可逆沉淀反应。三、主要器材、试剂和药品酒精灯、试管、移液管、胶头滴管、木试管夹、鲜鸡蛋、HCl、NaOH、硫酸镀、硫酸铜、丙酮等。四、操作步骤1、20%蛋白液2m1+lmol/LIICl2ml2、20%蛋白液2mi+lmol/LNaOH2m13、20%蛋白液2ml+蒸憾水2ml,置于酒精灯外焰上加热4、

4、20%蛋白液2nd,逐渐加入硫酸镀粉末5、20%蛋白液2nd加入少许硫酸铜6、20%蛋白液2ml加入丙酮10滴五、实验报告分别描述上述6个步骤的现象并解释其原因。实验二豚酶Km值简易测定一、目的要求1.学习Km的双倒数作图法。2.了解酶的性质及Km的含义。二、基本原理腺被腮酶催化分解，产生碳酸钱。碳酸钱在碱性溶液内与奈氏试剂作用，产生橙黄色的碘化双汞钱，在一定范围内，呈色深浅与碳酸钱多少成正比。故借比色法可测定单位时间所产生碳酸钱量，从而求得酶促反应速度。在保持恒定的合适条件（时间、温度及pH）下，以同一浓度的嫌酶催化不同浓

5、度的腺分解，于一定限度内，酶促反应速度成正比，因此，用酶促反应速度倒数（1/v）为纵坐标，.眠浓度倒数（1/c）为横坐标，依L、K法作图，即可求出腺酶的Km值。三、主要器材、试剂和药品无水酒精、尿素（AR）、Na2HPO4（AR）、KH2PO4（AR）、硫酸锌、O.5mol/LNaOH>lOOg/L酒石酸钾钠、O.lmol/L腺液、腺酶液、碘化钾、碘、汞、奈氏试剂、显色液、1/15mol/LPB（磷酸缓冲溶液，pH7.0）、豆粉、恒温水浴锅、72型分光光度计、小漏斗、漏斗架、滤纸、移液器、水浴加热锅等四、操作步骤取试管5支，

6、编号依下表加入试剂管号1234对照腺液终浓度/（mol/L）1/1001/1501/2001/2501/250.眠稀释液加入体积/ml0.20.20.20.20.2浓度/(mol/L)1/201/301/401/501/501/15mol/LPB(pH7.0)0.60.60.60.60.6腺酶液/ml0.20.20.20.2—煮沸眠酶液/ml————0.2摇匀，37°C水浴15min100g/LZnSO40.50.50.50.50.5蒸憾水333330.5mol/LNaOH0.50.50.50.50.5充分摇匀，室温下静放5

7、min,过滤，另取5支中试管，同上编号，接下表加入滤液/ml111I1蒸馆水/ml22222显色液/ml0.750.750.750.750.75迅速摇匀，用72型分光光度计，42（Jnm,以对照调0,测定各管/值。作图：以腺液终浓度［1/d为横坐标，1/Z（1/卩）为纵坐标作图，然后依［1/d找出对应1/力点，将各点连成延长与［1/c］轴相交，得一1/Km。五、注意事项1、操作中，每加一样试剂请务必摇匀，尤其中37°C保温后和加显色液二步。2、变性麻酶，要煮沸完全，沸后继续加热片刻，以防空白管读数偏髙。3、一些重金属离子、硫

8、胺、蛋白质等可影响酶的活性，故实验后务必要自来水冲洗、然后用少量蒸馆水冲洗彻底清洁试管、漏斗等玻璃器皿，以防影响酶的活性。4、pH、离子强度、温度、试管的洁净程度等均可彫响酶的活性，故务必固定实验条件，严格按操作程序进行操作。六、实验报告用双倒数作图法求出Kmo附：1、奈氏试剂母液：取KI