方法简介ppt课件

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1、PCR方法简介王媛媛PCR概念PCR即聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction），是利用单链寡核苷酸引物对特定DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。PCR原理PCR反应类似于DNA的天然复制过程，由三个循环的步骤构成：模板DNA的变性模板DNA与引物的退火(复性)引物的延伸PCR原理图解1stcycle2ndcycle3rdcycle过程变性引物退火DNA延伸PCR反应体系DNA模板Primer1Primer2DNA聚合酶dNTPsPCRbufferddH2OPCR体系对反应物的要求引物引物设计的一般原则长度：一般20—30nt

2、，应大于16nt。碱基分布：随机或均匀分布，避免嘌呤或嘧啶的连续排列。碱基组成：GC含量在45%—55%之间。二级结构：应避免引物二聚体和发夹结构。碱基配对：引物与模配对，3´端完全配对，5´端可不配对，故可设计酶切位点或其他需引进的序列。3´端碱基：最好不用A。PCR体系对反应物的要求引物浓度引物浓度引物浓度过高会增加扩增结果的非特异性，并且会形成二聚体上下游引物的终浓度应该一致PCR体系对反应物的要求DNA聚合酶常用的为从嗜热水生菌（ThermasaquaticusL.）中提取的DNA聚合酶，称TaqDNA聚合酶95℃可保持活性70—75℃条件下

3、可表现出最佳的生物活性，延伸速率在70℃时，60—70nt/秒，每分钟大于3.5kb具体使用时，作为一个普遍规律，每扩增1kb，可用1分钟延伸时间碱基错配率达2×10-4—7.2×10-5酶浓度范围一般为1～4U/100μl酶量过多会导致非特异产物的增加PCR体系对反应物的要求PCR反应的缓冲液Taq酶标准缓冲液：10mmol/LTris-HCl(pH8.3)50mmol/LKCl1.5mmol/LMgCl2PCR体系对反应物的要求PCR反应的缓冲液Mg2+浓度影响反应特异性和PCR产率。Mg2+最佳反应浓度相当低（1.5mmol/L），浓度变化范围

4、为1～10mM模板制备过程中带来的螯合剂（如EDTA）和负电荷离子基团（如磷酸根（dNTP）会影响Mg2+的有效浓度。必要时，对Mg2+浓度进行优化。PCR体系对反应物的要求dNTPs高浓度的dNTP会抑制聚合酶活性，而且会增加错误dNTP的掺入几率；浓度过低则会影响产物产量四种dNTP的浓度应该一致PCR反应条件的选择94℃4min94℃30sTm-5℃30s72℃1min/1kb72℃10minTm=4(G+C)+2(A+T)30cyclesRT-PCR原理ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction:

5、RT-PCR提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因RT-PCR原理图解RT-PCR反转录酶的选择Moloney鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶，有强的聚合酶活性，最适作用温度为37℃禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性，最适作用温度为42℃RT-PCR合成cDNA引物的选择Oligo(dT)与mRNA分子3′端的poly(A)互补特异性强,仅mRNA可被转录Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%,此种引物

6、合成的cDNA在数量和复杂性方面要小难以得到﹥3kbcDNA,对某些RNA二级结构难以克服。RT-PCR合成cDNA引物的选择随机六聚体的核苷酸特异性差克服反转录酶终止反应的序列。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNART-PCR合成cDNA引物的选择特异性寡核苷酸引物特异性强RACEcDNA末端快速扩增技术(rapidamplificationofcDNAends)3′RACE原理反转录：利用mRNA的3′末端天然的poly(A)尾巴作为引物结合位点，以Oligo(dT)和一个接头组成的接头引物(adaptorprimer,AP)来反转录

7、总RNA得到加接头的cDNA第一链。第一PCR：然后用一个基因特异引物GSP1(genespecificprimer，GSP)和接头引物AP进行PCR反应。从而扩增位于已知序列区和poly(A)尾之间的未知的3′端mRNA序列。第二次PCR：防止非特异带的产生,可以用GSP2和AP为引物进行第二轮扩增(巢式PCR)5′RACE原理反转录：与3`RACE原理类似，用一个反向的基因特异引物（GSP-RT)在反转录酶(reversetranscriptase,RT)作用下反转录得到cDNA第一链加尾：再用脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)给cDNA的3′末

8、端进行同聚物加尾反应,从而在未知的cDNA的5′端加上一个poly(A)接头PCR引物：然后再用基因特异引物