抗体纯化及纯 度的检测课件20121127ppt课件

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1、抗体纯化及纯度的检测林英生物技术学院2012.11.27抗体纯化的方法①超速离心分离—是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适宜少数大分子物质的分离。【其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、Ficoll分离法（聚蔗糖—泛影葡胺液）。】②选择性沉淀—选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境。核酸去除法盐析沉淀法有机溶剂沉淀法高分子聚合物沉淀法例：50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白；8%～12%PEG6000可沉淀IgG。③超滤法—利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛。④层析法—凝胶过

2、滤、离子交换、亲和层析IgA相对分子量160,000，IgM相对分子量1000,000，故可通过分子筛将两者分开而得到纯品。⑤电泳—SDS-PAGE一、硫铵盐析法简便、蛋白质变性较少，33%饱和度的硫铵可以沉淀所有各类免疫球蛋白；缺点是分离的纯度较差，对IgA类抗体来说，浓盐可使其形成二聚体，不宜采用。一、原理当高浓度盐存在时，蛋白质表面的电荷基团和极性基团与溶液中的离子配对，瓦解了以电荷为基础的蛋白质---蛋白质相互作用。加之高盐能促进蛋白质表面疏水区的相互作用，形成蛋白质聚集体，并从水中分离析出沉淀。这一技术称为“盐析”。不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀，所以盐析常用于蛋白质的

3、粗分离纯化。硫酸铵是分级沉淀蛋白质的一种极有用的盐，它具有保护蛋白质的活性、pH范围广、溶解度高、溶液散热少和经济适用等一些优良性质。硫酸铵浓度常以百分浓度表示。以X%表示所要配制的溶液浓度，X0%表示开始的溶液浓度，所需的硫酸铵克数按以下公式计算：g=515×(X-X0)/(100-0.27X)(0℃时1L溶液)操作步骤将硫酸铵晶体在乳钵中研磨成粉末状；将盛有5ml蛋白质溶液（血液或消化液）的烧杯放在另一装有冰水的溶器内，并置于磁力搅拌器上搅拌；加5mL生理盐水，边搅拌，边徐徐加入1.06g硫酸铵粉末至20%饱和；在4℃放置1h后，用8000g离心20min；取上清液转入另一烧杯，放

4、在冰水的溶器内，在磁力搅拌器上边温和搅拌，边加入3.84g硫酸铵粉末至80%饱和；4℃放置2h后，用8000g离心20min；弃去上清液，取0.5mL生理盐水溶解沉淀；装入透析袋，用0.0175mol/LPBS（pH7.4）透析1d，期间换透析液6次。二、Cohn冷酒精沉淀法：凝胶过滤(分子筛)层析三、层析分离离子交换层析法三、层析分离四、硫铵盐析和DEAE-纤维素柱层析法纯化IgG在pH7.5的溶液中IgG带正电，其他血清蛋白带负电，因此阴离子交换剂DEAE-纤维素可以一次将IgG提纯到很高的纯度四、IgM的纯化方法：18%饱和度硫铵沉淀+DEAE-纤维素柱层析法。将透析管剪成适当长

5、度（10－20cm）的小段，即透析袋。2.在大体积的2％（m/V）碳酸氢钠和1mMEDTA（pH8.0）中将透析袋煮沸10min。3.将透析袋用蒸馏水彻底漂洗。4.将透析袋置于1mMEDTA（pH8.0）中煮沸10min。（也可将透析袋放在广口瓶中充满水，松动瓶盖，于20psi高压灭菌10min。）5.待透析袋冷却，存放于4℃，应确保透析袋始终浸没在液体中。6.使用前用蒸馏水将透析袋里外加以清洗。透析袋的处理鉴定：鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及免疫学活性蛋白的含量———定氮（紫外光280nm等）分子的质量———电泳、质谱蛋白的纯度———电泳等免疫学活性———免疫双扩散、免

6、疫印迹免疫血清的保存：1.4℃保存（6个月）2.低温保存（-70℃～-20℃，5年）3.真空干燥保存（5～10年）注意点：保存前需经除菌保存液含防腐剂避免反复冻融（分装）谢谢！