青霉菌的原生质体制备技术研究

《青霉菌的原生质体制备技术研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、青霉菌的原生质体制备技术研究薛康平任富亮邢建广王越甲摘要：实验证明青霉菌原生质体形成最佳条件是用马铃薯液体培养基，液体震荡培养温度28℃,培养42h，蜗牛酶的浓度为5mg/ml，酶解3.5h，酶解温度33℃,稳定剂采用0.7mol/LNacl，此条件下能够制备最大量的青霉菌原生质体。关键词：青霉菌原生质体蜗牛酶1原生质体简介细胞壁被酶水解剥离，剩下有原生质膜包围着的原生质部分称为原生质体Weibull等于1953年首次用溶菌酶处理巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)细胞获得原生质体。其形状随不同菌类

2、而异，革兰氏阴性菌经酶水解后细胞壁尚有残余部分，细胞具刚性，保持球形，称为原生质球或球质体；革兰氏阳性菌细胞壁去除彻底，失去刚性，原生质体类似于球体。不论原生质体或原生质球都基本保持原细胞结构，活性和功能，只是因为它们去掉了细胞壁，对渗透压特别敏感。原生质体诱变是一种行之有效的育种新技术，它是以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。Kim等于1983年首先采用该法诱变玫瑰色小单孢菌（Micromonosporarosaria）取得成功以来，应

3、用逐渐广泛，已在抗生素，酶制剂，有机酸及维生素等高产突变株的选育中起到重要的作用。丝状真菌原生质体的提取方法有三种：机械法，非酶分离法和酶法。采用前二种方法制备的原生质体效果差，活性低，仅适用于一些特定菌株，因此并未得到推广。在实际工作中，最有效和最常用的是酶法，该法时间短，效果好。到目前为止，适合于原生质体分离的各种酶类已经得到开发和应用。酶法分离原生质体的方法：首先选择原始亲株，经过遗传标记筛选，得到直接亲本，采用培养皿平板玻璃纸或摇瓶震荡法培养，取年轻的菌体转入到高渗溶液中，加入有关水解酶，在一定条件下（温度

4、，pH值等）酶解细胞壁[7]。酶解后释放的原生质体和残存菌丝片断的混合液经G-2和G-3砂芯漏斗过滤，除去大部分菌丝碎片。滤液进一步低速离心10min,洗涤后弃去上清液，沉淀悬浮于同一种高渗溶液中，即可得到纯化的原生质体。酶法分离原生质体的本质是以微生物细胞壁为底物的酶水解反应，作为底物的细胞壁，其组成与结构又与培养基成分，培养条件，菌齢和预处理等因素有关。2材料与方法2.1材料2.1.1菌株青霉菌，来自河北科技大学（生物科学与工程学院微生物实验室保藏菌株）2.1.2培养基马铃薯低渗培养基马铃薯等渗培养基（即含0.

5、7mol/lNaCl的上述培养基）2.1.3试剂蜗牛酶，石炭酸复红染色液，蔗糖，KH2PO4.7H2O，MgSO4，酵母膏，NaCl。2.1.4仪器与设备（1）IA-1003电子天平,TGL-16C台式离心机，光学显微镜，超净台，恒温箱，电磁炉，4℃冰箱，高压灭菌锅。（2）移液枪及枪头，1.5ml离心管，小医用注射瓶，100ml量筒，锥形瓶，培养皿，烧杯，镊子，酒精棉球，绳子，接种针，封口膜，报纸。2.2方法2.2.1配制马铃薯低渗培养基（1）称取土豆434.97g，切成小块，放入锅中煮。用纱布过滤除去土豆泥，得到

6、土豆汁500ml。（2）称取2g蔗糖，0.5gKH2PO4.7H2O、0.5gMgSO4、1.5g酵母膏放入烧杯中，从原土豆汁中取出160ml一并放入烧杯，再加水至500ml。（3）取100ml于锥形瓶中，加入2g琼脂，其余的分装入3个锥形瓶。（4）做好标记，与培养皿一起放入高压锅中灭菌。（5）灭完菌后，固体培养基倒平板，液体培养基放入4℃冰箱保存。2.2.2配制马铃薯等渗培养基（1）称取0.4g蔗糖，0.1gKH2PO4.7H2O、0.1gMgSO4、0.3g酵母膏放入烧杯中，从原土豆汁中取出32ml一并放入烧杯

7、，再加0.7mol/l的Nacl至100ml。（2）称取2g琼脂放入烧杯中。（3）混匀后分装入5个锥形瓶。（4）做好标记，与培养皿一起放入高压锅中灭菌。2.2.3配制不同浓度的蜗牛酶液(1)称取20mg蜗牛酶于小医用注射瓶中，并加水至2ml，此即为浓度10mg/ml的蜗牛酶液。(2)从上述酶液中分别取80、240、400、560、720于小医用注射瓶中，并补水至800ul。(3)此即为浓度分别为1、3、5、7、9mg/ml的蜗牛酶，用记号笔做上标签。2.2.4配制0.7mol/lNacl溶液称取32.76gNacl

8、固体溶于无菌水中，定容至800ml，灭菌并4℃保存。2.2.4青霉菌菌株的活化将保存在冰箱中的青霉菌接种在新配制的马铃薯固体培养基中。28℃恒温箱中培养2-3d。2.2.5原生质体制备(1)接种：培养好后，从平板培养基中，取一环菌接种于马铃薯液体培养基中，33。C恒温摇床分别培养36h、42h、48h。(2)离心：将培养好的青霉菌在12000r/min下离心