阿仑膦酸钠对人骨髓间充质干细胞体外骨向诱导的研究

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1、阿仑膦酸钠对人骨髓间充质干细胞体外骨向诱导的研究[]目的探讨不同浓度阿仑膦酸钠对人骨髓间充质干细胞体外骨向诱导增殖和成骨诱导分化能力的影响。方法取生长状态良好的第四代细胞，分为实验组(不同浓度的阿仑膦酸钠，A-F组)、空白对照组(L-DMEM，G组)和阳性对照组(地塞米松，H组)各自诱导成骨分化。观察细胞形态，放射免疫法检测各组hBMSCs骨钙素的分泌能力实时荧光定量PCR检测各组细胞培养液中Runx2和OsxmRNA的表达情况，并检测经成脂肪细胞诱导分化后细胞内脂蛋白脂酶(LPL)mRNA的表达情况。结果hBMSCs诱导分化至第7天时，A-F组大部

2、分细胞仍呈长梭形，G组部分细胞开始出现形态学改变；各组细胞培养基中骨钙素均随诱导分化时间推移而增多；各组细胞表达Osx和Runx2mRNA也随诱导分化时间推移而增多；hBMSCs经诱导分化21d时，A-F组细胞Osx和Runx2mRNA表达量进一步增加，E组和F组超过半数细胞阳性表达，高于其他阿伦磷酸钠工作液诱导组；在阴性对照组，始终未见有细胞形态学改变、骨钙素表达和Osx和Runx2mRNA表达。结论ALN能促进hBMSCs增殖和骨向分化，1×10-6mol/L为其诱导分化的合适浓度。　　[关键词]阿仑膦酸钠；人骨髓间充质干细胞；体外诱导；骨向分化

3、　　[]R329.2[]B[]1005-0515（2012）-01-045-01　　　　阿仑膦酸钠可以抑制各种情况下的骨量丢失，包括原发性骨质疏松和肢体制动、双侧卵巢切除术后等各种原因造成的继发性骨质疏松[1.2]，同时可以提高骨生物力学水平。研究发现在组织水平，阿仑膦酸钠能够降低骨转换，形成钙正平衡，使骨量增加，但其分子机制目前还不十分清楚，一般认为其作用的靶细胞为成熟的破骨细胞[3]，也有人认为阿仑膦酸钠在一定浓度下可影响成骨细胞的增殖，甚至可能促进成骨细胞成熟分化[4.5]，另外不排除在诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化方面起作用。目前，阿伦磷酸

4、钠对成骨细胞的增殖有不同的研究结果，多数学者认为适宜浓度下阿伦磷酸钠促进成骨细胞的增殖，甚至可能促进成骨细胞增殖或成熟分。但其浓度相关性影响细胞增殖的机制是怎样，有待进一步研究。笔者就不同浓度的阿仑膦酸钠对人骨髓间充质干细胞体外骨向诱导进行实验，发现了体外培养所需的最适浓度，现报告如下：　　1材料与方法　　1.1主要试剂、仪器和人骨髓间充质干细胞所需试剂、仪器与进行人骨髓间充质干细胞体外培养的实验相同(略)。　　1.2诱导分化步骤取融合至80%-90%第4代人骨髓间充质干细胞，进行分孔成骨诱导分化。每个96孔板分为8个组(A-H组，每组12孔),每个

5、孔加入不同浓度的阿伦磷酸钠工作液(购于石家庄制药集团有限公司)，浓度分别为1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L(分别为A-F组)，同时设立空白对照组和阳性对照组，分别加入等体积不含阿伦磷酸钠工作液的L-DMEM作为阴性对照组(G组)，和加入含浓度为1×10-8mol/L的地塞米松诱导液作为阳性对照组(H组)。将3个96孔板置于37℃、5%CO2的孵育箱内培养。3个96孔板细胞分别进行成骨诱导时间为7d、14d和21d，诱导分化期间每2天换液1次。　　1.3人骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨分化的

6、鉴定人骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨分化第7d、14d和21d时，分别进行放射免疫法对细胞培养液中骨钙素分泌能力进行检测和采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测诱导分化后的人骨髓间充质干细胞Runx2和OsxmRNA的表达情况，同时采用qRT-PCR检测经成脂肪细胞诱导分化后细胞内脂蛋白脂酶(LPL)mRNA的表达情况。　　1.4人骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨分化细胞形态变化人骨髓间充质干细胞进行诱导成骨分化后，每两天显微镜下观察一次细胞形态改变情况，同时观察细胞生长、成骨分化情况。　　1.5放射免疫法检测细胞培养基中骨钙素含量骨钙素放射免疫

7、试剂盒购于中国原子能科学研究院。放射免疫仪型号为：Fj-2008全自动免疫计数仪(西安262厂生产)。放射免疫法的具体步骤参照试剂盒说明书。将成骨诱导分化7d、14d和21d后的细胞培养基进行收集，分析培养基中骨钙素的含量。　　1.6qRT-PCR检测诱导分化细胞的LPL、Runx2、Osx、β-actin表达通过以下五步骤进行操作，具体(略)：(1)引物设计合成；(2)细胞总RNA的提取；(3)逆转录反应；(4)荧光定量PCR反应；(5)LPL、Osx和Runx2mRNA表达量分析。　　2结果　　2.1细胞诱导成骨分化形态改变到第7天时，A-F组阿

8、伦磷酸钠工作液诱导组大部分细胞仍呈长梭形，只有小部分细胞见形态发生变化，空白对照细胞形态无明显变化(图1)。