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1、E.Z.N.A.TotalRNAKitI(R6834-0150preps)步骤A．真核细胞和组织自备材料：β－巯基乙醇、70％乙醇（DEPC水配置）、除RNase的枪头和EP管、disposablelatexgloves。细胞的步骤1．在microfugetube中用TRK裂解缓冲液裂解细胞，使细胞团松散，轻弹EP管或者用枪头吹旋，再用漩涡振荡混匀。使用前每1mlTRK裂解缓冲液加入20ul的β－巯基乙醇。如果是单层的组织培养细胞（成纤维细胞，内皮细胞等），可以直接在细胞培养器里裂解细胞。吸净培养基后直接加TRK裂解缓冲液至细胞中。加6
2、00ul的TRK到T35细颈瓶或10cm的培养皿中，更小的培养器则加350ul的TRK。Pipettebufferoverentiresurfaceofvessel以使裂解完全。将液体布满整个器皿表面，确保细胞裂解完全。将裂解产物转移至干净的1.5mlEP管中，然后进行第2步。如果细胞是悬液培养，收集细胞（≤1,500rpmor400*g）*5min，弃上清，加入TRK）裂解液，漩涡振荡混匀（具体略，见说明书）。2．匀浆化裂解产物“裂解和匀浆化样品”－第四页有更详细的说明，如果细胞≤1*105，漩涡振荡1min。样品匀浆化不完全会显著的
3、减少RNA的产量并容易造成柱子堵塞。a)用匀浆器（rotor-stator）30s，使样品匀浆化，而后进行第3步。b)使裂解产物通过钝的针头的注射器（0.9mm直径20-gauge），使之匀浆化。注射器要除RNase。进行第3步。c)将裂解物转移入omegahomogenizerspincolumn,10000g离心1分钟。将flow-though移入新的tube中，进行第3步。组织的步骤：1．TRK裂解缓冲液在microfugetube中裂解细胞，使用前每1mlTRK裂解缓冲液加入20ul的β－巯基乙醇。350ulTRK裂解液最多能有
4、效裂解20mg组织（-3mm3）。对20mg以上组织用600ul的TRK裂解液。然而，不要超过30mg组织，这是推荐的最大量。对组织样品，匀浆化参照第四页，选择一种方法使用，除非是使用液氮，在TRK液/beta巯基乙醇中匀浆样品而后进行step2。1．离心，>1,4000*g（maxispeed）,5min,室温。将上清液移入一新的1.5ml管中，而后进行第3步。总RNA分离：（pufifyRNAbyusingHiBindTMRNAColumn）2．向裂解产物中加入等体积（350ul或600ul）的70%乙醇，mixthoughlyby
5、pipeting。3．Apply样品到HibindRNAMinicolumn上。thespincartridge的最大容量为750ul（更大体积也能加上）。Aprecipitatemayformonadditionofethanolinstep3。加完乙醇后可能会形成沉淀。所以要充分振荡将所有的混合液加入到柱子上。Withthespincolumninsidea2mlcollectiontube,室温离心，10,000*g,0.5-1min。弃去流出液（透过柱子流出到离心管里的液体）而后进行第五步。4．将柱子放在一个新的2ml收集管中，
6、加上300ulRNAwashbufferI。室温离心，10,000*g,0.5-1min。同样弃掉流出液。在第6步中重新使用收集管。如果要on-membraneDNaseI消化，进行第6步，否则进行第7步。5．DNaseI消化（选择性）（详见说明书）。6．将柱子再放到同一个2ml收集管中，加入500ulRNAwashbufferI,室温离心，10,000*g,30－60s，弃流出液。7．将柱子放到一个新的2ml收集管中，加入500ulRNAwashbufferII（乙醇稀释过的），室温离心，10,000*g,30－60s，弃流出液。在第
7、9步中重新使用这个收集管。（注意：使用前RNAwashbufferII必须要用无水乙醇稀释，按照标签上的说明。）8．用500ulRNAwashbufferII洗涤一次柱子，同上一步骤一样。室温离心，10,000*g,30-60s，弃流出液。然后使收集管空着，20,000*g,2min,室温离心，使的HiBind基质完全干燥。9．洗脱RNA。转移柱子到一个新的1.5ml的Ep管中，（试剂盒中没有提供），加入30－50ul的DEPC水洗脱柱子（试剂盒中提供）。确保水直接加到了柱子的基质上。10,000*,1min,室温。如果RNA的总量大于
8、30ug，可以进行二次洗脱。注意：可以选择性地，可能会用更多的水洗脱RNA。如果进行二次洗脱，总RNA的量会增加，但是浓度会降低，因为80％以上的RNA会在第一次时被回收。离心前将水加热到70℃并室温孵育柱
