蛋白质生化技术课件

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1、蛋白质生化技术南开大学生命科学学院ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity叶丽虹SELDI蛋白指纹技术GSTPull-Down报告基因系统PTDs蛋白质芯片-飞行质谱系统及其在分子生物学中的应用背景介绍蛋白指纹质谱技术（SELDI，SurfaceEnhancedLaserDesorption/Ionization，表面增强激光解吸技术）是2002年诺贝尔化学奖的核心技术，具有快速、简单和灵敏等优点,它不仅可在肿瘤诊断中用于发现标志物、观察治疗效果,还可用于研究蛋白质的修饰、相互作用、信号传导

2、和酶促调节等,从而实现在蛋白质水平的大规模功能研究。传统蛋白组学研究（2D-MS）的局限性由于外加电场下的PH梯度不稳定，重复性差加样量小，分离的蛋白质很难鉴定可分析的蛋白质最多约1500种，难以检出蛋白质中占很大比例的低丰度蛋白质对于分离跨膜蛋白仍是技术难点电泳胶上的蛋白质斑点很大部分包含一种以上蛋白，以依次鉴定单个蛋白斑点为基础，限制了检测通量消耗时间长，一次电泳要5小时以上对技术水平要求高，不能完全自动化染色转移等环节操作技术条件要求高，耗时，不适应于大规模筛查和临床检测SELDI技术的优势直接用粗生物样品（血清、尿、体液

3、）进行分析同时快速发现多个生物标记物微量样品(asfewas2000cellsforLCMsamples)高通量的验证能力（with1000sofsamplesamonth）发现低丰度蛋白质测定疏水蛋白质:与“双相电泳加飞行质谱”相比，除了有相似功能外，并可增加测定疏水蛋白质在同一系统中集发现和检测为一体特异性高：利用单克隆抗体芯片，可鉴定未知抗原/蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量可以定量：利用单克隆抗体芯片，由于结合至芯片上的抗体是定量的，故可以测定抗原量，但一般飞行质谱不用于定量分析功能广：I.利用单克隆抗体芯片,可替代

4、WesternBlotII.利用单克隆抗体芯片,可互补流式细胞仪不足的功能，如将细胞溶解，可测定细胞内的抗原,而且灵敏度远高于流式细胞仪系统介绍SELDI技术的蛋白质芯片－飞行时间质谱仪器由三部分组成：蛋白质芯片阅读器（ProteinChipReader）飞行时间质谱检测系列（PBSIIC系列）分析软件（ProteinChip软件）。操作流程示意图生物初样品（血清/细胞裂解液）：蛋白质通过亲合作用结合到芯片的化学或生物位点上；清洗蛋白质芯片：用水洗去非特异性结合的蛋白质和缓冲液中的杂质，以消除干扰；加能量吸收分子EAM（Ener

5、gyAbsorbMolecule）or“Matrix”：芯片经室温干燥后，加能量吸收分子EAM到每个点上，使其与蛋白质结成混合晶体，以促进蛋白质在飞行时间质谱检测中的解吸附和离子化SELDI蛋白质芯片的制备123飞行时间质谱检测激光解吸电离的方法将保留在芯片上的蛋白质解离出来电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱被精确地测定出它们的质量ProteinChipReader工作草图ProteinChip软件化学表面芯片分为疏水、亲水、阳离子、阴离子和金属离子螯合芯片五种，用于检测未知蛋白，获取指纹图谱。化学表面芯片可以直接用粗生物样品（血

6、清、尿样、体液）进行分析，能同时快速发现多个生物标记物，测定疏水蛋白质特别是膜蛋白。芯片的种类生物表面芯片生物表面芯片分为抗体－抗原、受体－配体和DNA－蛋白质芯片等种类，可显示与之相结合的抗原或者配体的不同分子量亚型，这种芯片的特异性高，可以定量。蛋白质芯片系统提供了一个单一、快速和特异的平台，成为蛋白质组学研究的多个领域的强大平台。能够用于下列研究：生物标志物发现、表达差异绘图、作用差异绘图、抗体抗原作用、DNA与蛋白的相互作用、蛋白鉴定和多肽作图、蛋白质纯化、表位作图、糖基化分析、磷酸化/信号传导途径分析、蛋白与蛋白之间作

7、用、受体配体作用、毒性标志物发现、临床数据分析等。在发现生物标志物上的优势抓住了疾病的本质，绝大多数疾病都有特异的生物标志物（Bio-marker），在SELDI技术中质谱的峰值是对这些生物标志物最直接的反映。有一套灵敏的检测系统来检测和识别这些微量的生物标志物。发现生物标志物能够对许多不同的样品进行比较分析，软件功能强大，分析获得的谱图可以多种形式表示，并应用叠加合成等手段筛选出特别的差异峰，从而确定生物标志物，该方法迅速便捷。蛋白质纯化提供了便捷的蛋白质纯化方法，能够优化最佳色谱条件（如PH值、洗脱条件），对目的蛋白质进行有

8、效的分离。蛋白质鉴定从蛋白质芯片对结合的蛋白质进行消化，或者事先对蛋白质混合物进行蛋白酶切处理，再结合到蛋白质芯片。结合质谱分析，能够得到消化片段的分子量，从数据库中进行检索就能够获得相应蛋白质的序列信息。分子间作用预先对芯片的点进行处理，偶联抗体或者其他蛋白（