蛋白质的分离纯化及鉴定技术生化分析课件

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1、第八章蛋白质的分离纯化及鉴定技术蛋白质相对分子质量常用研究方法：1.根据化学组成测定最低相对分子质量2.渗透压法测定相对分子质量3.沉降分析法（离心）4.凝胶过滤法测定相对分子质量5.聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量1.根据化学组成测定最低相对分子质量用化学分析方法测定出蛋白质中某一微量元素的含量，推导出蛋白质最低相对分子量。例如，肌红蛋白含铁量为0.335％，其最低相对分子质量可按下式算出：最低相对分子质量=铁的原子量铁的百分含量X100注意：最低相对分子量=（55.8/0.335）X100=167002.

2、渗透压法测定相对分子质量（1）渗透(osmosis):溶剂分子由纯溶剂(或稀溶液)向溶液(或浓溶液)单方向的净移动现象.（2）理想溶液中，溶液的渗透压与溶质浓度的关系可用范托夫公式表示：π=cRT／Mrπ渗透压(单位为Pa)；c溶质的浓度；T绝对温度(K)；R气体常数；Mr溶质的分子质量3.沉降分析法（离心）利用超速离心测定蛋白质的相对分子质量，沉降的速率与蛋白质分子大小和密度有关，而且与分子形状、溶液的密度和粘度有关。当分子以恒定速度移动时，净离心力与摩擦力处于平衡状态时，根据斯维得贝格方程：Mr=RTS/D(

3、1-νρ)T是绝对温度(K)；R是气体常数；S为沉降系数（单位离心场的沉降速度，用10-13秒作为一个单位）；D为蛋白质的扩散系数；ρ为溶剂密度；ν为蛋白质的偏微比容（约为0.74cm3/g），通过测得蛋白质的s值和D值，就可以算出蛋白质的相对分子质量。电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系：logMr=a—bμR式中Mr为相对分子质量，a、b都是常数，μR是相对迁移率：μR=样品迁移距离/前沿（染料）迁移距离实验测定时，以几种相对分子质量标准物蛋白质的Mr的对数值对其μR值作图，根据待测样品的μR,从标准曲线

4、上查出它的Mr。蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度或比活，以增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性(比活常以活力单位数／毫克蛋白质表示)。分离纯化某一特定蛋白质的一般程序：前处理粗分级分离细分级分离蛋白质分离纯化的一般原则1.前处理(pretreatment)分离纯化某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。（1）预处理：动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免受杂质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等

5、脱脂。（2）破碎：然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。植物组织和细胞，由于具有细胞壁，一般需要用与石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法破碎，液氮破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎的常用方法有超声波震荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理(分解肽聚糖)等。（3）提取：组织和细胞破碎以后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤等方法除去。如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开。如

6、果所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。2粗分级分离(roughfractionation)目的：当蛋白质提取液获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。这一步的分级分离一般用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法(如聚乙二醇浓缩法)进行浓缩。3细分级分离(finefractionation)进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶

7、过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。4结晶结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。结晶也是进行X射线晶体学分析所要求的。一、蛋白质含量测定两类方法利用蛋白质的物理性质，如折射率

8、、比重、紫外吸收等利用化学方法测定蛋白质含量，如：微量凯氏定氮、双缩脲反应、Folin-酚试剂法蛋白质的含量测定与纯度鉴定1.凯氏定氮法是经典的标准方法，用浓硫酸消化蛋白质分解出氨，测定氨的含量，除以16%，就得出蛋白质的含量。2.双缩脲法双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由氢氧化钾、硫酸铜和酒石酸钾钠配制。当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，形成紫红