单抗的发展与应用

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1、©2006Accenture.Allrightsreserved.1Monoclonalantibodytechnology©2006Accenture.Allrightsreserved.2轻链（L）由约214个aminoacid组成，分两种：Kappa（κ）和Lambda（λ），重链由450-550个aminoacid组成，根据其抗原性差异可分为5种：μ链、γ链、α链、δ链和ε链。由此将免疫球蛋白分为M、G、A、D和E。©2006Accenture.Allrightsreserved.31抗体技术的发展单克隆抗体技术的发展第1代单抗技术：鼠源性单克隆抗体第2代单抗技术：嵌

2、合性单克隆抗体第3代单抗技术：人源化单克隆抗体第4代单抗技术：全人源化单克隆抗体©2006Accenture.Allrightsreserved.41细胞工程单克隆抗体©2006Accenture.Allrightsreserved.52单链抗体（scFv）SOE法构建scFv基因产物VHVLVLVH变性、复性接头DNA，（Gly4Ser）3引物引物接头DNAPCR重叠延伸拼接法（SOE），是把Linker的编码序列分别设计在扩增VH和VL引物中，用PCR直接合成scFv基因。scFv的优点是分子量小、免疫原性弱、渗透力强，并具有药物导向、中和毒素等功能，不需要进行糖基化修饰

3、，可以在原核表达系统中进行表达。缺点是无抗体C区，不能介导抗体的其他生物学活性。©2006Accenture.Allrightsreserved.63Fab抗体Fab抗体分子的制备PrVHVHVLCLCH1CH1VLCLS-S-H链表达载体L链表达载体共转染细胞抗体分泌细胞Fab片段是由H链Fd段和完整L链通过二硫键形成的异二聚体，仅含有一个抗原结合位点，大小为完整抗体的1/3。可利用噬菌体构建表达有天然构象的Fab片段。Fab片段有中和毒素和病毒，封闭受体和药物的螯合作用，其免疫原性低，但半衰期比完整抗体短的多。Pr©2006Accenture.Allrightsreser

4、ved.74抗体库技术抗体库按基因的来源可分为：鼠源性抗体库，人源性抗体库和驼源性抗体库抗体库展示技术：噬菌体表面展示技术，酵母表面展示技术，核糖体展示技术抗体库技术的优点：1不需要进行细胞融合，避免了因杂交瘤不稳定而需要反复亚克隆的繁琐程序。2扩大了筛选容量，可达到106以上的克隆，而杂交瘤技术一般只能筛选约1000个克隆。3可直接克隆到抗体的基因，便于进一步构建各种基因工程抗体。4得到的抗体可以进行原核表达，降低制备成本。5构建抗体库时由于H链和L链V区基因在体外随机组合，因而可以获得新的特异性抗体。已有的噬菌体抗体库：抗HIV，麻疹病毒，破伤风类毒素，呼吸道合抱病毒，乙

5、肝病毒，单纯疱疹病毒糖蛋白和TNF-α等的抗体库。©2006Accenture.Allrightsreserved.8构建方法1动物免疫2血清效价检测3淋巴细胞的分离纯化4总RNA提取5第一链cDNA反转录合成6轻、重链基因的扩增7scFvDNA的组装与扩增8scFvDNA片段的SfiI/NotI酶切9pCANTAB5E–scFv重组质粒的构建10重组噬菌体的制备11库容量的滴定12单链抗体噬菌体抗体库的富集淘选4.1噬菌体展示技术构建和筛选scFv图片来源：苏州康宁杰瑞生物科技有限公司©2006Accenture.Allrightsreserved.94.2噬菌体展示技术构

6、建和筛选Fab抗体构建方法淋巴细胞分离、总RNA提取及cDNA的合成与scFv抗体库的构建相同1PCR扩增Fd及轻链基因2PCR扩增产物的纯化3轻链基因的克隆4重链Fd基因的克隆及噬菌体抗体库的建立和鉴定5Fd基因的克隆及抗体库的建立6抗体库的富集和筛选©2006Accenture.Allrightsreserved.104.3酵母表面展示技术酵母表面展示技术是继噬菌体展示技术之后发展起来的真核展示系统，不仅能筛选噬菌体抗体库的全部抗体，而且能筛选新型抗体，是噬菌体抗体库筛选抗体的两倍。酵母存在MATa和MATα2种交配型单倍体细胞。酵母表面展示技术有两种：a凝集素展示系统是

7、将目的蛋白的C端与a凝集素的Aga2亚基的N端融合；α凝集素展示系统是将目的蛋白的N端与α凝集素的C端融合。α凝激素展示系统原理图©2006Accenture.Allrightsreserved.115特殊基因工程抗体1.7.1双特异性抗体BsAb图片来源：武汉友芝友生物制药有限公司利用基因重组和抗体工程技术，由大容量抗体库的构建及优化系统，高通量抗体筛选系统，体内体外抗体验证系统三大部分组成，制备高效的肿瘤治疗性抗体，对乳腺癌，淋巴瘤和结肠癌进行针对性的治疗。细胞工程BsAb将2株分泌不同特异性单抗的