腺病毒载体操作手册1407-r2

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1、腺病毒载体操作手册腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-I

2、RES-RFP,pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。17腺病毒载体操作手册1、载体信息1)腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：腺病毒载体名称干扰pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP过表达pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP标记示踪pHBAd-CMV-IRES-GFP,17

3、腺病毒载体操作手册pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10%FBS)。3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存17腺病毒载体操作手册293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在70%以下，QBI-

4、293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL37℃预热的10％DMEM，用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可

5、，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mLeppendorf管中，加入450ul10％DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。17腺病毒载体操作手册5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞，密度为3x106个/ml。6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。7、第

6、二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。（二）293A细胞的传代当细胞生长到汇合率达到80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。1、消化细胞，方法同细胞冻存。2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。3、根据具体情况，将细胞分到10cm培养皿中，每个培养皿补足到10ml培养基。4、将培养皿平稳放回37℃、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。（三）293A细胞的复苏当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。1、设置温度为37~42℃的水浴

7、。2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在17腺病毒载体操作手册1~2min内使细胞溶液完全溶解。3、将细胞溶液转移到15ml离心管中，并在其中加上1ml新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm，5min。4、去掉上清，加入5ml新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入6cm培养皿。5、将培养皿平稳放入37℃、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中培