烟草内生细菌yn201448的定殖能力研究

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中国烟草科学ChineseTobaccoScience2015．06，36(3)烟草内生细菌YN201448的定殖能力研究杨珍福，何鹏飞，一，吴毅歆。，一，毛自朝，何月秋1,2(1．云南农业大学植物保护学院，昆明650201；2．云南农业大学农学与生物技术学院，昆明650201；3．微生物菌株筛选与应用技术国家地方联合共建工程中心，昆明650471)摘要：为测定烟草内生细菌YN201448的定殖能力，通过自然转化法将携带绿色荧光蛋白基因的质粒pGFP4412成功导入YN201448细胞中，获得了GFP标记菌株48-pGFP。48一pGFP能稳定表达GFP蛋白，且对5种病原真菌的拮抗能力与野生型YN201448的相同。用48-pGFP菌液浸泡烟草种子和浇灌烟草苗后，在烟草的根、茎、叶等组织中都能检测到标记菌，其定殖数量分布为根>茎>叶；同时标记菌也能在根际土中稳定地定殖。激光共聚焦显微镜观察发现标记菌株主要聚集在烟草茎组织的表皮、皮层部位及维管组织。因此，YN201448可以在烟草体内外较长期定殖。关键词：解淀粉芽孢杆菌；绿色荧光蛋白；拮抗作用；自然转化中图分类号：$435．72文章编号：1007．5l19(2015)03．0080．06DOI：10．13496d．issn．1007—5119．2015．03．016TheColonizationofEndophyticBacteriumYN201448inTobaccoYANGZhenfu，HEPengfei，一，WUYixin，一，MAOZichao，HEYueqiu1，2(1．FacultyofPlantProtection，YunnanAgriculturalUniversity(YAU)，Kunming650201，China；2．FacultyofAgronomyandBiotechnology,YAU，Kunming650201，China；3．NationalandLocalJointEngineeringResearchCenterforScreeningandApplicationofMicrobialStrains，Kunming650471，China)Abstract：InordertodeterminethecolonizationofendophyticbacteriumYN201448intobacco．wesuccessfullyobtainedastableGFPtaggedstrain48IpGFPbytransferringthepGFP4412plasmidintoYN201448vianaturaltransformation．48-DGFPshowedthesameantagonisticeffectagainst5pathogenicfungiasthewildstrainYN201448．48．PGFPwasobservedtobedistributedinroot．stemandleaftissuesoftobaccoafteritsseedssoakedandseedlingrootsdrenchedwith48-pGFEThecolonizingbacteriulndecreasedwimthetrendofroot>stem>leaf,and48DGFPcouldcolonizeinrhizosphericsoilstably．Fluorescencemicroscopeobservationindicatedthat48．oGFPmainlyappearedintobaccostemepidermis．COrtexandvasculartissuecells．Therefore．YN201448couldcolonizeinsideandaroundtobaccoplantstablyforarelativelylongperiodoftime．Keywords：Bacillusamyloliquefaciens；GFP；antagonisticeffect；naturaltransformation植物体内存在大量的内生细菌，它们因植物法等[嗣。过去应用较为广泛的是抗生素标记法，该组织的保护，而免受外部恶劣环境的影响，对植法虽然简便、快速、消耗低且结果可统计分析，但物具有广泛的生物学作用[卜1。利用植物内生细菌其精确性低、回收下限高[。近年来随着分子生物作为生物制剂或生物肥料对植物进行生物预处理学技术的不断发展，基因标记技术越来越为人们具有广阔的应用前景，掌握其定殖情况是进行生重视，其中绿色荧光蛋白(GFP)由于具有性能稳产应用的前提l】。目前用于检测内生细菌在植物定、检测方便、灵敏度高的特点已被成功用于观体内定殖的方法包括抗生素标记法、基因标记法、察细菌侵入植物的过程以及细菌在植物组织中的同位素示踪法、DNA和RNA探针法、免疫学方具体定殖部位【8-】¨。基金项目：科技部国际科技合作项目“防治植物病害和促进植物生长的微生物开发应用及机制研究”(2000DFA326360)；中国烟草总公司云南省公司项目“普洱市烤烟‘两黑病’综合防控技术研究与应用”(2015YN26)作者简介：杨珍福(1988一)，硕士研究生，主要研究方向为植物病理学。E—mail：ynjcyzf152@126．tom。通信作者，E-mail：ynfh2007@163．com收稿日期：2014—08．31修回日期：2015—03-30 第3期杨珍福等：烟草内生细菌YN201448的定殖能力研究81YN201448是从烟草体内筛选的内生解淀粉茄枯萎病菌、稻瘟病菌等为试验材料。当空白对芽孢杆菌，平板对峙试验表明其对多种病原菌有照的病原菌长满平板时，观察接种拈抗菌的培养抑制作用，经温室试验和田间使用证明其对烟草皿中拮抗带宽度的变化，对比两者的拮抗带宽度，黑胫病有很好的防病作用，且对多种作物具有促得出标记菌是否具有相同的拮抗能力，以此来判生长作用。本研究运用质粒的接合转移方法对断其是否适用于定殖和生物防治研究。YN201448进行GFP标记，将GFP质粒转到1．2_3GFP标记菌在烟草体内外的定殖研究(1)YN201448菌株中，获得具有绿色荧光的菌株48．浸种处理：云烟97种子经酒精消毒后，用标记菌pGFP，这使我们实时动态地监测其在烟草体内外菌悬液(1．00~10’cfu／mL)浸泡24h，取出种子，的定殖情况成为一种可能。研究YN201448菌株用灭菌水冲洗4次后置于垫有湿润滤纸的培养皿在烟草上的定殖情况，有助于进一步了解该菌株内，于28℃光照培养箱中保湿培养。种子发芽后的防病促生机制，也为今后进一步开发成植物生取O．5g幼苗，用酒精消毒后，再用无菌水冲洗4防制剂和促生菌剂提供理论依据。次。将植物组织研磨成浆状物，并稀释成不同浓度，静置3min。取150L汁液涂抹于含20~g／mL1材料与方法卡那霉素的LB平板上，28℃下黑暗培养48h，1．1材料在紫外投射仪照射下统计平板上发绿色荧光的菌供试菌株：烟草内生解淀粉芽孢杆菌落数，计算含菌量[(菌落数×稀释倍数X分离用水YN201448，真菌病原菌：烟草黑胫病菌毫升数)÷(涂板用水毫升数×分离组织克数)]。(Phytophthoraparasiticavar．nicotianae)、禾谷镰以清水浸种为对照，每处理重复3次。刀病菌(Fusariumgraminearum)、稻瘟病病菌(2)灌根处理：将长势一致的5～6片真叶(Magnaportheoryzae)、番茄枯萎病菌(F．期的烟草苗根拔起洗净后移栽在装有未灭菌自然oxysporum￡sp．1ycopersici)、玉米弯孢霉叶斑病菌土的花盆中后，用GFP标记菌菌液(1．00x10(Curvularialunata)等均为本试验室分离保存。cfu／m1)灌根处理。分别于处理后第1、5、l0、25、质粒：含有卡那霉素抗性基因的pGFP4412质50天取样，测定拮抗细菌在烟草根、茎、叶内的粒由中国农业大学王琦教授惠赠。供试烟草：云定殖情况。以烟草根灌清水为对照，每处理重复3烟97品种5～6叶期烟苗。细菌增殖采用LB培养次。在组织分离的同时，称取烟草根际土于无菌基，自然转化生长采用GCHE和GC培养基【】。水中，摇床震荡30rain后，进行一系列梯度稀释后涂布在含有卡那霉素的LB平板上，测定标记1．2方法菌在根际土中的菌落变化情况。选择处理ld和1．2．1拮抗细菌YN201448的GFP标记解淀粉10d后的烟草样品，切取用无菌水清洗过的烟草芽孢杆菌YN201448的自然转化，采用Idris等【】根、茎组织，压片法制片，在激光共聚焦显微镜下提供的两步法。将转化成功的菌株经不含卡那霉观察GFP标记菌株在烟草体内的定殖情况，以不素的LB培养液和平板交替继续培养5轮，再回接菌的烟草植株作为对照。接到含卡那霉素的LB平板上检测，以证实其质粒表达的稳定性。2结果1．2．2GFP标记菌株与YN201448野生菌株拮抗2．1解淀粉芽孢杆菌YN201448的转化能力的比较测定采用平板对峙[13]试验比较GFP按照Idris等【]提供的方法，我们成功地将标记菌株和野生型YN201448菌株对植物病原真pGFP4412质粒导入解淀粉芽孢杆菌YN201448自菌的室内拮抗活性，其中植物病原真菌以烟草黑然感受态细胞中。pGFP4412标记的YN201448荧胫病病菌、禾谷镰刀病菌、玉米弯孢霉叶斑菌、番 中国烟草科学2015年第36卷烟草内生细菌[20-21]。本试验以GFP成功地标记了specificendophyticbacterialgenotypesbyplantsinresponsetosoilcontamination[J]．ApplEnviron该菌株，从而为研究其在烟草植株不同部位的分Microbiol，2001，6(67)：2469-2475．布状况、定殖规律、促生长和防病机制提供了有[2]龚明福，韩松，李超，等．苦豆子根瘤内生细菌分离及其对棉花枯萎病的生物防治效果测定[J]．微生物力工具。学通报，2011，38(6)：865—870．以标记菌株48-pGFP浸种和灌根处理，证明[3]RashidS，CharlesTC，GlickBR．Isolationand48．pGFP能在烟草体内定殖，灌根处理时，它在烟characterizationofnewplantgrowth-promoting草根、茎、叶内的定殖能力为：根>茎>叶，表明bacterialendophytes[J]．Appliedsoilecology，2012，61：217．224．该菌株进入烟草苗的根系后，能够转移到植株的[4】CoombsJT，FrancoCM．Visualizationofanendophytic茎和叶部组织。定殖数量动态在烟草的根、茎、叶Streptomycesspeciesinwheatseed[J]．ApplEnvironMicrobiol，2003，69(7)：4260—4262．等组织中均呈现“减一增一减”的变化趋势，且在根[5]卢镇岳，杨新芳，冯永君．植物内生细菌的分离、分内的数量变化明显比茎和叶内的平缓，此结果与类、定殖与应用[J1．生命科学，2006，18(1)：90．94．前人在其他作物上进行的定殖研究结果一致[22-24]。[6】张炳欣，张平．植物根围外来微生物定殖的检测方法生防菌在根部定殖能力的强弱决定着生防的成败[J】．浙江大学学报：农业与生命科学版，2000，26(6)：[6l，有益内生细菌B946[l在小麦体内，固氮菌624．628．DX120E[]在甘蔗体内均能很好定殖，但只有当定[7]刘忠梅，王霞，赵金焕，等．有益内生细菌B946在小麦体内的定殖规律[J】．中国生物防治，2005，21殖达一定数量时，才能有效阻止病原菌侵染植物。(2)：113．116．本研究中48pGFP在烟草体内的定殖随着植株的[8]范晓静，邱思鑫，吴小平，等．绿色荧光蛋白基因标生长有所减少。因此，为了更好地发挥其防病促记内生枯草芽孢杆菌[J]．应用与环境生物学报，生长作用，在实际应用中可以根据需要适当补施，2007，13(4)：530．534．来保证YN201448在烟草体内的定殖菌落数。由[9】彭伟，谭悠久，黄永春．GFP标记的多粘芽孢杆菌1114于菌株经过GFP标记不能在大田中做相关试验，在番茄根际的定殖[J]．中国生物防治，2010，26(3)：307—3I1．为了接近大田生长情况，本试验采用未灭菌的自[10]殷幼平，袁训娥，李强，等．生防菌枯草芽孢杆菌然土来做定殖研究，表明野生型菌株YN201448亦CQBS03的绿色荧光蛋白基因标记及其在柑橘叶片能在自然土中很好定殖。上的定殖[J]．中国农业科学，2010，43(71)：3555—3563．4结论[11]XiaoT，TanS，ShenQ，eta1．BacilluscereusX5suppressesroot-knotnematodeoftomatobycolonizing本研究获得了烟草内生解淀粉芽孢杆菌inrootsandsoil[J]．AfrJMicrobiolRes，2012，6：2321—YN201448的GFP标记菌株48-pGFP，并通过对2327．【12】IdrisEE，IglesiasDJ，TalonM，eta1．Tryptophan-峙试验证明标记菌株对5种病原真菌的拮抗能力dependentproductionofindole一3一aceticacidrIAA)与野生型菌株的相同，用48-pGFP菌液对烟草进affectslevelofplantgrowthpromotionbyBacillusamyloliquefaciensFZB42[J]．MolecularPlant—Microbe行浸种和灌根处理，均能回收到标记菌株，表明Interactions，2007，2O(6)：619—626．YN201448能在烟草体内外很好的定殖，具有进一【13]方中达．植病研究方法【M】．北京：中国农业出版社，1998．步开发成植物生防制剂或促生菌剂的潜力。【14】李伟观，奚家勤，薛超群，等．烟草内生菌研究概况致谢：感谢中国农业大学植物病理系王琦教及其应用【J]．中国农学通报，2010，26(7)：225．授无私地惠赠带卡那霉素抗性基因的质粒228．pGFP4412。【15】KloepperJW，BeauchampCJ．Areviewofissuesrelatedtomeasuringcolonizationofplantrootsbybacteria[J]．参考文献CanJMicrobiol，1992，38(12)：1219—1232．[16]CompantS，KaplanH，SessitschA，eta1．Endophytic【1]SicilianoSD，Fo~inN，MihocA，eta1．SelectionofcolonizationofVitisviniferaL．byBurkholderia 第3期杨珍福等：烟草内生细菌YN201448的定殖能力研究85phytofirmansstrainPsJN：fromtherhizosphereto【21】杨珍福，吴毅歆，聂兴成，等．3株烟草内生细菌促进inflorescencetissues[J]．FEMSmicrobiologyecology，作物生长作用的研究[J]．江西农业学报，2014，262008，63(1)：84·93．(11)：58．6O．【17】左存武，孙清明，黄秉智，等．利用根系分泌物与绿[22】刘云霞，张青文．水稻体内细菌的动态研究[J]．应用色荧光蛋白标记的病原菌互作关系鉴定香蕉对枯萎生态学报，1999，10(6)：735．738．病的抗性[J]．园艺学报，2010，37(5)：713—720．[23】龙良鲲，肖崇刚．内生细菌01．144在番茄根茎内定殖【l8】徐明，桂月晶，祁伟彦，等．绿色荧光蛋白基因标记的初步研究[J]．微生物学通报，2003，30(5)：53—棉花黄萎病菌[J]_植物保护，2013，39(5)：128—56．。133．[24】吴蔼民，顾本康．内生菌73a在不同抗性品种棉花体【19】闰立敏，王晓鸣，徐荣旗，等．利用绿色荧光蛋白报内的定殖和消长动态研究[J]。植物病理学报，2001，告基因标记研究麦根腐平脐孺孢对小麦根和叶片的31(4)：289—294．侵染[J]．中国农业科学，2012，45(17)：3506．3514．【25】魏春燕，邢永秀，莫遥，等．绿色荧光蛋白基因标记【20】杨珍福，吴毅歆，陈映岚，等．烟草拮抗内生细菌的的固氮菌DX120E在甘蔗植株内的定殖[J]．作物学筛选与防病促生长效果[J】．中国烟草科学，2014，35报，2014，40(6)：1132．1139．(6)：48—53．《烟草科技》2015年第6期目次⋯⋯⋯⋯李泽锋，魏攀，夏玉珍，等1⋯⋯⋯⋯．．张春，赵浩淳，郭涛，等9⋯⋯⋯．．邓小华，罗伟，周米良，等13⋯⋯⋯．．战徊旭，时焦，孟坤，等19⋯⋯⋯．姚先洪，郭群召，牛寻，等23⋯⋯⋯．．孙学辉，朱静，王宜鹏，等27⋯⋯⋯．．高云才，刘玲，徐昭梅，等34⋯⋯．．冯明飞，刘俊辉，卢斌斌，等40⋯⋯⋯李有桂，卢梦梦，朱成峰，等45⋯⋯⋯张世敏，李翔，谢复炜，等52⋯⋯⋯⋯肖华玲，文建辉，银董红，等57⋯⋯⋯．庞永强，李雪，罗彦波，等64⋯⋯⋯．夏玉珍，王毅，牟定荣，等68⋯⋯⋯．．王宏铝，王筑临，许小双，等73⋯⋯⋯李壮，金军杰，王吉翠，等78⋯⋯⋯．李秀芳，朱子玉，谢建，等83⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯同学斌87