玉米内生细菌解淀粉芽孢杆菌y19rifm在玉米根部定殖能力的研究

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玉米科学2015，23(4)：132～137JournalofMaizeSciences文章编号：1005-0906(2015)04—0132—06DOI：10．13597~．cnki．maize．scielqce．20150423玉米内生细菌一解淀粉芽孢杆菌Y19-RifM在玉米根部定殖能力的研究郭力维，吴毅歆一，何月秋，。(1．云南农业大学，农业生物多样性应用技术国家工程中心，昆明650201；2．云南农业大学农学与生物技术学院，昆明650201；3．微生物菌种筛选与应用国家地方联合工程研究中心，昆明650207)摘要：采用逐步提高LB平板中利福平浓度的方法，从具有促生长和防病潜力的玉米内生细菌解淀粉芽孢杆菌Y19中筛选出获得抑菌活性不变的抗利福平(250I-Lg／mL)突变菌株Y19一RifM，研究Y19一RifM在玉米根部定殖能力。结果表明，玉米出苗后25、30、35、40、45、50、55d，从根际、根表、根内均能回收到抗性菌落。根际、根表的回收菌量保持在1~10～1~104CFU，g的水平，根内保持在lxlOCFU／g的水平，灭菌土中回收到的菌落数量高于自然土中菌落数量。关键词：玉米；玉米内生细菌；解淀粉芽孢杆菌Y19中图分类号：$435．131文献标识码：AColonizationofEndophyticBacillusamyloliqruefaciensY19一R．fMinCornRhizosphereGUOLi～wei，WUYi—xin，HEYue—qiu'，(1．NationalEngineeringCenterofAppliedTechniquesforAgriculturalBiodiversity,YunnanAgriculturalUniversity(ra，Kunming650201；2．FacultyofAgronomyandBiotechnology,YAU,Kunming650201；3．NationalandLocalJointEngineeringResearchCenterforScreeningandApplicationofMicrobialStrains，Kunming650207，China)Abstract：ColonizationabilityoftheendophyticBacillusamyloliquefaciensYI9withgoodabilitiestopromoteplantgrowthandinhibitfunga]pathogenswasstudiedbyarifampicin(250lxg／mL)resistantstrainY19—_RifMob—tainedfromLBplateswithaseriesofincreasingantibioticconcentrations．Y19一RifMcouldberecoveredfromrhi—zosperesoil，rootsurfaceandinnerroottissuein25，30，35，40，45，50and55daysafterao133emergencyinthegreenhouse．Theresultsshowedthatthecolonynumberreachedupto1x10。一1×104CFU／gfromcornrhizosphereandrootsurfaceand1×10CFU／gfrominnerroottissue．Thecolonynumberforthecorngrowinginsterilizedsoilwashigherthanthatinnaturalsoil．Keywords：Corn；Endophyticbacterium；BacillusamyloliquefacieusY19植物促生长根际细菌(PlantGrowthPromoting素，对调节土壤肥力、植物营养和植物病害有着举足Rhizobacteria，PGPR)作为土壤和植物的桥梁和中轻重的作用。长久以来，选育抗性品种、化学药剂和介，在植物一微生物一土壤三元关系中是最活跃的因农业措施是防治植物病虫害的主要措施。近年来，生物防治因其具有对环境、生态、人类健康安全及农业可持续发展等优势，受到国内外的高度关注并发收稿日期2O14-04-08挥着越来越重要的作用]。随着PGPR研究的兴基金项目国家“863”计划项目(2011AA10A205)、云南省农业产业起，越来越多具有促生防病优良性状的内生菌从室技术体系项目内研究转入田间应用阶段。然而在实际生产中，由作者简介郭力维(1987一)，女，云南盈江人，硕士，主要从事植物病于受生物因素和非生物因素的影响，外来微生物在理学研究。E～mail：g87112w12@163．corn何月秋为本文通迅作者。E—mail：ynfh2007@163．con根际的定殖能力仍然是内生有益菌株应用的一个关 4期郭力维等：玉米内生细菌一解淀粉芽孢杆菌Y19一RifM在玉米根部定殖能力的研究133键要素。生物因素包括外来微生物本身的生理特性1．2．3Y19-RifM对病原真菌的抑制能力测定及其与土著微生物的相互作用，宿主植物的基因型；3种指示性病原真菌在PSA平板上扩繁。用灭非生物因素包括光照、降水、温度、土壤类型H1。优菌打孑L器制备直径0．5cm的病原真菌菌饼，菌丝面异的具有控制病害作用的PGPR可在作物根系定殖朝下接种于直径9cm的PSA平板中央，再按十字交后，优先利用根系分泌物并占据根部空间，甚至内叉位置在距离菌饼3cm处点接种Y19一RifM，以生，减少病原微生物营养和侵染位点[6j，寄主根系也Y19一W作为对照。将培养皿倒置于25℃下培养。能更快捷地吸收到PGPR的代谢产物。为了更好地待未接种Y19的指示病原真菌菌落直径达9cm后，利用PGPR，了解其在根围、根内定殖能力是非常必采用十字交叉法分别测量Y19一RifM和Y19一W的抑要的。在研究过程中，采用抗生素标记菌株来区分菌带宽度(指2个接菌点连线上的无菌区宽度)，并计施入的PGPR与其他土著微生物是最常用方法]。算菌落生长抑制率，重复3次。生防菌与目标作物间良好的亲和能力是发挥稳生长抑制率=【(对照菌落直径一处理菌落直径)／定生防效果的关键，定殖是植物内生菌在植株体内(对照菌落直径一0．5)ix100％。发挥生物学功能的前提和基础。本实验室从玉米种1．2．4玉米植株的准备子内分离到的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamylolique—将Y19一RifM接种于LB培养液中，于150r／min、faciens)Y19是一株具有广谱抑菌作用及促进植物生37℃摇床中培养至浓度l×10CFU／mL。将取自云南长作用内生菌株，能有效预防和控制玉米小斑病、圆农业大学农场的红壤土样过筛，除去石块、枯草等杂斑病、弯孢霉叶斑病等玉米常见病害，且具有促进植物后均匀混合，装人塑料盆(直径×高度为10cmX株生长效果。解淀粉芽孢杆菌在玉米植株体内的定15cm)中，厚度约10cm；另取部分土样，121~C湿热殖能力和动态还不清楚。因此，研究该菌株在玉米灭菌60rain，隔夜灭菌3次，再按同样方法装入塑料上的定殖能力和动态，为发挥其防病、提高植株产盆中。挑选子粒外观饱满无病虫危害的健康玉米种量、开发植物微生态制剂提供理论依据。子，表面消毒和冲洗后吸干多余水分、自然晾干，分别按4粒／盆的播种量直接播种于盆中，25d后每盆1材料与方法只保留1株。播种后，采用浇灌法于每粒种子附近1．1实验材料的土壤中施入Y19一RifM菌悬液1mL，在种子上方内生根围细菌：解淀粉芽孢杆菌Y19(下称野生覆盖约1cm厚的土壤，置于温室中培养。以LB培型Y19即Y19一w)。病原指示真菌玉米小斑病菌(Bi—养基浇灌为对照，每个处理重复4次。polarismaydis)、玉米圆斑病菌(Bipolariszeicola)、轮枝1．2．5Y19一RiflVl的分离镰孢菌(Fusariumverticillioide)，均为本实验室分离和待玉米苗长出第4真叶(第20天)后开始取样，保藏菌株。此后每隔5d取样1次，共取样7次，即分别于出苗后1．2实验方法25、3O、35、4O、45、50、55d取样。参照王志远等人”1．2．1诱导利福平抗性菌株的方法，取样调查根际土、根表土、根系以及茎秆和活化菌株Y19，挑取单菌落接人含有利福平叶片组织。取样时将玉米植株轻轻地从土中拔出，(10~g／mL)的LB液体培养基中，在150r／min、37~C条各重复取1株，共取4株。件下于摇床中培养24h，再吸取菌液移至含有利福根际土：取拔出的玉米苗，充分抖动植株，收集平(25~g／mL)的LB液体培养基中培养。按照此方抖落的土壤，称取重量后置于装有50mL无菌水的法，依次经过10、25、50、100、150、200、250、300g／mL三角瓶中，摇床上100r／min振荡30min。利福平的含量筛选获得利福平抗性菌株(Y19一RifM)。根表土：将采过根际土的玉米根系剪下，称质量1．2．2Y19-RifM培养特征和抗性测定fM11，再置于装有50mL无菌水的三角瓶中，在摇床将Y19一RifM在LB固体培养基上连续继代培养上100r／min振荡30min后取出，用吸水纸吸尽根周l0次，再接种到LB液体培养基中，150r／min、37'E条围的水分后称质量fM2)，两次质量之差(M1-M2)即为件下于摇床中培养24h后，于含利福平(250~g／mL)培根表土的质量。养基上划线培养，观察其生长情况。另将4℃下保存根内：将称重后的根系至于75％酒精浸泡2min，6个月的Y19一RifM接种到含利福平(250~g／mL)培养无菌水漂洗3次，并用1％次氯酸钠浸泡5rain，然后液中培养，待液体变混浊后在含利福平的LB固体平转移至无菌水漂洗3次，用灭菌滤纸片吸干表面水板上划线培养。分，转移至灭菌研钵加水研磨，备用。并采用组织印 玉米科学3结论与讨论根际是内生细菌的十嘤来源，Il1下受剑系分泌物的诱导和自身竞争优势的影响以及根系什养供近年来，由于外来品种的大量增加，杂交品种所给，使得菌株吸附于植物组织根表，数不断增比重逐年加大，氮素化肥用量增加，玉米病虫害发加；然后通过气孔或者水孔等f．j然孔I：I或伤，或1；=}生危害加重。目前，病害防治主要以化学防治为主，通过产生果胶裂解酶渗透到组织内，降解细胞，使化学防治带来的农药残留、环境污染、病虫抗药性增目标菌株定殖于植物组织内I本试验采川灌根的强等一系列的问题已对人类健康造成潜在威胁，亟方法接种内生菌，从定殖密度的数情来，人致表现待有新的、高效的生物农药新品种投入市场，以满足为根表>根内>根际，即菌株Y19一RifM定殖密度随该领域的需求。时间的延长而变化，它不仅能够停存根表，r{_能解淀粉芽孢杆菌及其同属的许多菌种常作为促在根围和根内扩散，增强菌株任植株体内的分池乍根际菌(PGPR)和生物菌肥_81，通过直接和间接两围，为其在各组织部位发挥乍防和促牛作J{】创造条种疗式影响植物生长，直接的作用是PGPR能合成件。然而，随着接种时问的延长，Y19一RifM的数桀种化合物供植物利用或者有助于植物从环境中吸波动较大，这可能与取样误差火系彳_】．此外，n川收营养物质，如氮的固定、土壤养分的溶解、植物激片和茎秆中尚未分离得到H标菌株Y19-RifM，flJ能豢的产生等；而间接作用是PGPR能减轻或避免某是由于菌株的接种餐偏低、接种次数偏少及涂扳榆·种或几种病原微生物的危害，如与病原微生物竞测取样少有关。一方面，为_r提高¨标菌株植株争佗点、产生抗生素和诱导系统抗性等机制保护植各组织部位的定殖能力，应该考虑适时灌菌，补允物免受病原菌的危害和降低危害程度，对增加植物壤和植物体内拈抗菌株的数使其肜成优种群，的株高、干重、提高根茎重量以及增强植株长势等方以增强作物的抗病和促生效果；”一斤而，仪依靠均有显著作用Y19一RifM内生来防治米叶病害呵能难以研究表明，解淀粉芽孢杆菌是一类具有广谱抑现。喷施YI9一RifM虽然能控制米小斑痫、蹦病制真菌和细菌活性的拈抗细菌，具有潜在的生防价和弯孢霉叶斑病，管其存I大】能够很好定硝，值工英国等人从堆肥、土壤、甜瓜果实、粪便中分能否仅依靠『1身定殖叫制病僻还待进步离得到的解淀粉芽孢杆菌对镰刀菌、灰葡萄孢、链格验证。孢等多种果蔬病原真菌具有显著抑菌效果，其参考文献：作用机制主要是解淀粉芽孢杆菌通过产生多种抑菌【I1PascalF，Pri,'IMmii-C，I-f|l1．1hlrMulanlst)’Ite[otllott^f物质，主要有真菌蛋白、伊藤蛋白、几丁质酶来发挥nacearurnaspotential1)iocontrolag(illsI1rIolllat(iImcleii1wihlJ『．抑菌作用I”I。本研究证明，解淀粉芽孢杆菌Y19AppliedalldEm,i,’filllllelilalMicrobiIlI“，l99460(9t：3I75—3I81．：培养皿中对玉米小斑病菌、圆斑病菌、轮枝镰刀菌【2IBid(i(',hkaMJwa㈧】R．RamsM}：，el±II．I"aI}fliiohigi(al(!litI_trolintiI)lhl(：lions：nloniloringaliAustⅢlianfungalI“⋯IIllrgltlsH—钉很好抑制作用，并采用抗生素获得突变体，然后以hoppel’si11NorthAmeri~1I_II．㈨flingsol¨1rNati．nalAcadem)比较突变体与野生型菌株间的抑菌效果，证明利福ofSciencesotlheUnitedSlates()fAiil(~rica．199693(21：9I8坦I．、l抗性菌株与野生型菌株的抑菌效果没有显著差【3]Na,iyoshiK，WaiarIJ，Yoshihi,ON．Stall(HIippl‘essi,lflI)fh)lilllh)浇灌法接种后，生防菌株Y19一RifM在一定时liacterialwiltliy}lat·It^lial(~oagllhll；‘}『lusing¨ilt!WILIIll：tio,,alIII)IY一内能够稳定地定殖于玉米根系，菌群密度保持在『I1erthat(~oagulalesImclerialc~llslllIltliosciencetlM,~elmoh,gyLIIItj1×10～1×104CFU／g的水平生防菌株Y19一RifM与Bl(1(’Ilenlisiry，200569(3)：537—543张欣，张平，晓破．影响rj1人微，}i物哦的⋯隶⋯Ji米具有较好的亲和能力，这可能与陔菌株来源于l；~Jtt微牛念报，2000，l1㈨6：95I一953tL米有关。它在玉米体内不存在定殖障碍，这就构ZhangBX，Zhangr．(『IXIj．hIIorsaftif。IifIt’olorlizali(1lllIfin成_r在宿主体内稳定发挥生防效果关键的前提条troducedrnici001liliSill<-；OIIphuilrllots⋯Chinese．IoulIlklI『1IAP-件”。同时在自然土和灭菌土中定殖动态大致相pliedE(IIh)gy，2000，I1(6)：95I一953．(inChiriese)似，但是自然土的菌量低于灭菌土，这说明Y19一RifM[5]杜立新，}书亮，范，等．·芽他”闲Is一208删tlS一2㈣株定殖能力还受到土壤微生物的影响，这与杜立株在番茄叶面及土壤II1定殖能力的硼⋯．fr,Ll~农、l火、报，2004，27(61：78—82．新、乇志远”噜报道的结果相一致。因此，在农业生DuIX，FengSlJ．CaoK()tIalStMvO11‘¨l{ll1izal⋯⋯，I，Ⅲil1．,J恕使用该菌株发挥防病作用时应该提高菌株浓度的subtilisslraillsBS-208iltldI{S一209(illlihylh,Ithul(olliillldloand使用量或者增加使用次数，以增加菌株在自然环境soil[J1．JournalotAgl’i《·uhuralI『lisJtvolH1．42004，27(6i：78—条件下的存活量，使其更好地发挥生防作用。82．finCh_1,ese) 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