同种异体骨移植修复过程中转化生长因子1表达的实验研究课件

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1、同种异体骨移植修复过程中转化生长因子β1表达的实验研究梁炳生关海山山西医科大学第二医院骨科前言转化生长因子β1（TGF-β1）是一种多肽类多功能生长因子，可以调节多种细胞或瘤细胞的生长分化，在骨组织中受损伤刺激可启动新生骨与软骨的生成。动物实验证明，外源性TGF-β1能够促进骨折愈合。目前认为，TGF-β1表达量的变化可直接反映成骨能力的强弱，其基因表达信号的强弱可反映生成量的多少。本研究采用免疫组化和原位杂交方法，观察分析同种异体骨移植修复过程中，术后时间、移植骨处理以及供受体间主要组织相容性抗原是否相配等因素对移植骨局部内源性TGF-β1表达的影响，旨在为进一步研究异体骨移植

2、愈合机理以及临床合理使用重组生长因子提供实验依据。材料与方法本研究采用2×2×4三因素析因试验设计方法。根据供受体间主要组织相容性抗原是否相配将实验动物随机分为两个大组，即主要组织相容性抗原相配组和不配组。各大组再随机分为两个处理组，分别是新鲜异体骨移植组和冷冻异体骨移植组。一、实验设计表1：实验动物分组情况及处理四、动物模型建立LEW大鼠48只做为受体。0.6%戊巴比妥钠（5ml/kg）腹腔注射麻醉，腹卧位固定，左后肢前外侧切口，长约3cm，切开皮肤、皮下组织，沿肌间隙分离，暴露股骨中段，口腔科高速裂钻截骨，造成股骨干中段3mm×4mm大小的骨缺损模型。将移植骨正位植入后，逐层

3、缝合伤口。五、主要试剂TGF-β1免疫组化试剂盒及TGF-β1原位杂交试剂盒（武汉博士德生物工程公司提供）。六、观察方法取材后组织标本以10%中性福尔马林固定48-72小时；10%EDTA脱钙2周，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5um连续切片，分别进行HE染色，TGF-β1免疫组化染色及原位杂交检测。光镜下观察各组移植骨修复情况。将已判定为阳性的组织切片，随机抽样做空白对照，以PBS缓冲液代替一抗或杂交液。其他步骤不变。以空白对照实验的染色程度确定是否阳性,≤空白实验染色强度为阴性,>空白对照染色强度为阳性。阳性表达以组织和/或细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为判断标准。以乳腺癌标

4、本作为阳性对照。七、图像分析和统计学方法1．骨组织形态计量分析每张HE染色组织切片随机选取5视野，经计算机自动图像处理系统计算新生骨组织密度。新生骨组织密度=新生骨组织面积/总骨面积。2．TGF-β1原位杂交结果图像分析将原位杂交组织切片随机选取5个视野，经计算机自动图像处理系统提取图中表达阳性信号彩色阈值，计算平均光密度值。以上数据统计学处理采用SAS软件，进行2×2×4析因方差分析。数据以均数±标准差表示，P﹤0.05有显著性差异。结果一、组织学观察※主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植：⑴骨吸收不明显，死骨含量少。⑵术后1周，移植骨表面、髓腔及移植骨-宿主骨间隙有新生骨样

5、组织生成；2周时，移植骨浅表处生成编织骨；4周，板层骨与编织骨掺杂出现；8周，板层骨排列整齐与移植骨紧密地整合在一起，髓腔再通。⑶上述部位增殖、分化的成骨细胞、间充质细胞内TGF-β1蛋白及mRNA表达阳性。※主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植：⑴移植骨边缘有骨吸收现象，骨内有死骨成分。⑵术后第2周，移植骨周围、髓腔及移植骨-宿主骨间隙有新生骨样组织出现；4-8周时，板层骨、编织骨掺杂出现且位置表浅，髓腔内有残余骨小梁。⑶移植骨周围、髓腔及移植骨-宿主骨间隙增殖、分化的成骨细胞、间充质细胞内TGF-β1蛋白及mRNA表达阳性。※主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植：⑴骨吸收

6、活跃，且移植骨周围有大量多核巨细胞浸润。⑵术后2周，移植骨边缘及髓腔内有少量新生骨样组织出现；至8周时，新生骨组织很少，移植骨内仍有大片均质状死骨。髓腔无再通迹象。⑶上述部位增殖、分化的成骨细胞、间充质细胞内TGF-β1蛋白及mRNA表达阳性。※主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植：⑴移植骨边缘有骨吸收现象，骨内有死骨成分。⑵术后2周，新生骨样组织出现；4-8周时，板层骨、编织骨掺杂出现，位置表浅，与移植骨整合不紧密，髓腔内有残余骨小梁。⑶TGF-β1蛋白及mRNA表达主要定为于新生骨组织表面的成骨细胞、间充质细胞内。图1．术后2周，主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植（HE

7、×100）图2．术后2周，主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植（HE×100）图3．术后2周，主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植（HE×100）图4．术后2周，主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植（HE×100）图1图2图3图4图5．术后1周，主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植（ISH×100）图6．术后1周，主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植（ISH×100）图7．术后2周，主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植（ISH×100）图8.术后2周，主要组织相容性抗