斑点大吴风草叶片再生体系的建立

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1、万方数据北方园艺2010(21)：177～179·生物技术·斑点大吴风草叶片再生体胡仲义，何月秋(宁波城市职业技术学院环境学院，浙江奉化315502)系的建立摘要：现以斑点大吴风草为试材，系统研究了灭菌方式、激素等因子对叶片再生的影响，建立了斑点大吴风草不定芽的高频再生体系。结果表明：建立斑点大吴风草无茵培养物的较好方法是0．1％HgCl2加吐温--80处理叶片10min；适宜的不定芽诱导培养基MS+6-BA1．5mg／L+NAA1．0mg／L；最佳的不定芽增殖培养基是MS+6-BA0．5mg／L+NAA0．1mg／L；其增

2、殖系数可达到6．05；其芽长至2～3cl'n时，最佳的生根培养基是1／2MS+NAA0．05mg／L，生根率达到100％，最终得到完整的植株。该再生体系可作为基因转化的受体系统。关键词：斑点大吴风草；叶片；不定芽；植株再生中图分类号：S688．4文献标识码：A文章编号：1001--0009(2010)21--0177--03斑点大吴风草(FarfugiumjaponicavaLauseomac—ulata)是菊科大吴风草属多年生草本植物，又称花叶如意，原产日本[1]。根状茎粗壮，叶面具有金黄色斑点，耐荫、耐寒、少病虫害，是优

3、良的庭园种植、城市绿化、背阴高架公路耐荫的地被材料，有着广阔的市场前景[2]。然而，目前的种子繁殖、分株繁殖等方法远不能满足市场的巨大需求，采用组织培养方法是一条有效的途径。周根余[3]、于爱萍[4]等以茎尖、无菌苗叶片为外植体进行其组培研究，但未见实现组培规模化生产。现首次采用地栽斑点大吴风草叶片作外植体不经过愈伤组织阶段而直接诱导出不定芽，取材方便，高效稳定，可大大降低生产成本。同时，不定芽每株每年以612的几何频率扩增，可在较短的时间内培育出大批商品苗。这不但为斑点大吴风草在市场大量推广打下基础，而且为研究斑点大吴风草

4、叶面斑点形成机理，并进一步应用转基因技术实现斑点大吴风草的品种改良提供一个良好的操作平台。1材料与方法1．1试验材料试验材料为宁波城市职业技术学院环境学院温室种植的斑点大吴风草。1．2试验方法1．2．1灭菌处理将斑点大吴风草幼嫩叶片从植株上小心剪下，带回实验室用洗洁精浸泡15rnin，后用流水冲洗4～5次；分装好后移至超净工作台采用不同的灭菌方法进行处理。第一作者简介：胡仲K．(1967-)，男，本科，副教授，研究方向为植物基础。基金项目：浙江省教育厅科研资助项目(Y200803329)。收稿日期：2010—06—281．2

5、．2诱导和分化培养诱导培养基以MS+琼脂7．0g／L+白糖30g／L，附加激素为6一BA和NAA，并参阅周根余口]、于爱萍‘4]使用的浓度，并采用四因素三水平正交设计[k(34)，表1]口]。培养基pH为5．8，在温度(25±1)℃、光照强度为40／皿nol·1TI-2·s～、在每日光照14h的条件下培养。接种4周后统计每个组织块所形成的不定芽数量。表1丛生芽诱导和丛生芽增殖的正交实验。∥L1．2．3不定芽的增殖培养不定芽长至1cm左右，将不定芽分割成2"--3个不定芽为一丛进行增殖培养。增殖培养基以MS+琼脂7．0g／L+

6、白糖30g／L，附加不同浓度的6-BA、NAA。接种15d后统计丛生芽的增殖系数。1．2．4生根培养不定芽长至2～3ClTI时，将不定芽分割成单个外植体，转入生根壮苗培养基，生根壮苗培养基与丛生芽诱导和增殖培养条件基本相同，只是基本培养为1／2MS、白糖15g／L附加不同浓度的NAA和IBA，转接15d后调查苗的生根率，20d后统计根长及生长状况。2结果与分析2．1外植体灭菌试验分析将不同灭菌方法处理的斑点大吴风草叶片接入培养基中，每天观察外植体的污染状况作好记录。接种10d以后，外植体的污染状况基本稳定。从表1可知，斑点大

7、吴风草叶片无菌体系比较难建立。主要因为叶片幼嫩，高浓度的灭菌剂导致绝大多数外植体出现褐177万方数据·生物技术·北方园艺2010(21)：177～179化、坏死现象，因此外植体的存活问题成为系统研究斑点大吴风草再生体系的重要障碍。试验表明，采用乙醇和升汞混合使用的方法时，尽管随着乙醇处理的时间增多，污染率略微有所下降。但成活率很低，最高仅有5％；单独采用升汞时，升汞处理时间为12min以上时，污染率有所下降，但叶片全部褐化死亡。相比较而言，采用升汞加吐温--80的处理方式是较为理想的斑点大吴风草灭菌方法，可以控制污染率在40

8、％左右，且能获得较高的成活率。表2不同灭菌方法对斑点大吴风草叶片的影响2．2斑点大吴风草叶片不定芽的分化2．2．1再生芽的获得斑点大吴风草叶片在分化培养基上培养，30d后叶片逐渐肥厚和肿大，在培养过程中边缘向远轴面卷曲，40d后在切口边缘长出不定芽(图1)，随后，经过转移后不定芽迅速扩大繁