高效液相色谱法定量测定微生物发酵产物辅酶q10

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1、曾试验测丹参酮IIA、丹参素钠、原儿茶醛、原儿茶酸以及阿魏酸的含量，结果测得含量均较低。丹参为方中君药，丹参水溶性部分主要含酚酸类成分，具有扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、改善微循环、抗凝、促进纤溶、抑制血小板聚集、抑制血栓形成等作用。丹酚酸B在丹参药材中含量较高，故丹酚酸B是本处方中的有效成分，且测定丹参中丹酚酸B含量的方法。专属性、重现性较强，所以本实验采用高效液相色谱法测定丹参中丹酚酸B(c。H。O。6)的含量．以控制本品的质量。3．2．1样品提取方法的选择考察了75％的甲醇超声提取1h、75％的甲醇加热回流lh、甲醇超声提取1h、o．1m1．L。盐酸超声提取

2、lh，结果75％的甲醇加热回流lh测得样品中丹酚酸B含量较高。(见表3)故实验中采用75％的甲醇加热回流lh的方法。3．2．2样品提取时间的确定采用75％的甲醇加热回流提取样品，分别测定了不同时间样品中丹酚酸B的含量，结果加热回流lh样品中丹酚酸B的含量较高。见表4。故本实验采用75％的甲醇加热回流1h的方法。表3提取方法的试验结果丹酚酸B音量12．87m∥九1917m∥丸1I笛m∥丸234m∥丸袁4提取对间的试验结果时间30minlh1．5h2h墨墅璧!宣量!i：墅竺芝垄堡竺竺￡壅!!：!!竺￡塾!垒竺必参考文献[1]卫生部药品标准中药成方制剂第十册[s】[工]

3、中国药典一都(s】．2∞5：52[3】中国药典一部[s】．2000：57【4】王怀明．孙启文等．丹参药材中丹参酮ⅡA和丹酚酸B的HPIc法测定[J]中国药师，2005．8(6)[s】肖风霞，壬风云等．高效液相色谱法测定益心片中阿魏酸和丹酚酸B的含量[J]．广州中医药大学学报，2005．22(4)[6]刘海清。吕东等．全国中药材市场商品丹参中4种丹参酮成分的HpIc法测定[J]．药物分析杂志．2005，25(2)高效液相色谱法定量测定微生物发酵产物辅酶Q。。啊碍口君(内蒙古金达威药业有限公司呼和浩转010206)辅酶Q。是类维生素物质，为脂溶性醌类化台物．是细胞呼吸

4、链上的一种递氢体，化学名为2，3一=甲氧基-5-甲基_6．癸异戊烯基苯醌．分子式为c，，H。O：⋯。辅酶Q，。作为一种多功能的生化药物．临床上可用于癌症的辅助治疗；用于治疗冠心病、心衰、心律失常等各种心脏病．对急慢性病毒肝炎、糖尿病、牙松动、肌无力、再生障碍性贫血、胃十二指肠溃疡、帕金森综合症等多种疾病也有辅助疗效”⋯。辅酶Q。。的生产方法主要有动植物组织提取法、植物细胞培养法、化学合成法和微生物发酵法。与其他生产方法相比，微生物发酵法原料廉价丰富，可以通过发酵罐法实现工业化生产，成为最具发展潜力的辅酶Q。生产方法”’，因此，微生物发酵法生产辅酶Q，。早已发展成热

5、点课题。但研究进展十分缓慢。主要技术难点是缺乏发酵产物的快速定量的测定方法。本实验报道一种基于丙酮超声提取”1和高效液相色谱法定量测定细菌细胞中辅酶Q．。的方法。本方法简便、准确，且能相对快速地测定发酵液中辅酶Q。的含量。可用于微生物发酵生产辅酶Q。的批量生产。l材料与药品1．1仪器KQ氆00DE型数控超声波清洗器(昆山市数控超声波有限公司)。A垂lentl200高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)。1．2主要试剂及标准品无水乙醇、丙酮、双氧水、盐酸均为国产分析纯．辅酶Q，。标准品，购自中国生物制品检定所。2方法与结果2．1辅酶Q。。的提取精密移取搅拌均匀的发酵液

6、10mL至loomL棕色容量瓶中，加2滴6m01．L“盐酸溶液，轻微振摇，先加20mL丙酮(分析纯)，再加lmL双氧水．最后用无水乙醇(分析纯)定容至刻度。在功率为250w的超声波清洗器上超声提取45min(温度控制在35℃以内)。2．2辅酶Q，。分析方法2．2．1色谱条件验证·202·根据《中国药典》2005年版所载的辅酶Q。。色谱条件进行试验。色谱条件色谱柱：Hypersil0Ds4．6mm×250mm，5¨目，不锈锕柱；检测波长：275n“；流动相：无水乙醇：甲醇=3：7；流速：2．0mL·m访～；柱温：35℃；进样量：20仙L。固I对照品田谱图2辅酶Q。发

7、酵液图谱由以上图谱表明：其主峰保留时间和对照品保留时闯一致。说明原色谱条件满足现检测方法的要求。2．2．2线性①标准溶液的制备：称取0-lg(精确至o．0001g)辅酶Q”对照品至I。0nlL棕色容量瓶中。加无水乙醇适量超声溶解，冷却，定容至刻度，备用。②工作曲线的绘制：准确移取辅酶Q，。标准溶液0．O。20，4．O，6IO，8-O．Io．o于100HIL棕色容量蕊中，加丙酮20IzlIJ，双氧水l玎lL，最后用无水乙醇定容至刻度，摇匀，过德，按2005版《中国药典》测定色谱条件(见2．2．I．1)分别迸样。以浓度(mg-100mL。)为横坐标．样品峰面积为纵坐标

8、，绘制标准