胶原蛋白酶对兔离体椎间盘类软骨细胞形态学的影响

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1、万方数据508生堡壁醛堂鲎查垫!Q堡!旦蔓垫鲞箜!塑垦垡!』叁塑堕!塑丝：叁匝!垫!!!!堂：!!!№：呈胶原蛋白酶对兔离体椎间盘类软骨细胞形态学的影响马文庭郑宝森史可梅李全波胶原蛋白酶化学溶解术是一种微创技术，已广泛用于慢性颈腰痛的治疗。椎间盘组织在大体结构上由软骨终板、纤维环和中央的髓核构成；在组织学上由丰富的细胞外基质和散在其中的类软骨细胞构成。细胞外基质主要由水、蛋白多糖和胶原构成，而胶原和蛋白多糖均由类软骨细胞分泌。本课题组前期研究表明，胶原蛋白酶可有效溶解椎间盘组织中的胶原纤维⋯。但其对椎间盘组织内细胞学的影响尚不清楚。本研究旨在观察胶原蛋白酶对体外培养

2、的椎同盘类软骨细胞形态学的影响，以探讨胶原蛋白酶的作用机制。材料与方法主要试剂和仪器胶原蛋白酶(1200U／支，批号：20040325，上海味邦乔源医药科技有限公司)、DMEM高糖培养基(Gibeo公司，美国)、20％胎牛血清(天津灏阳生物试剂公司)、Hank缓冲液(配方用去离子水配制)、转化生长因子口(佃D公司，澳大利亚)、青霉素100Ulml、链霉素100glml、0．25％胰蛋白酶(深圳晶美生物工程有限公司)。CKX31．A12PHP型相差显微镜(Olympm光学有限公司，日本)、5％C0，37℃恒温培养箱(Hirasawa公司，日本)。动物选择及处理选择健康

3、成年家兔18只，月龄2月，体重1．0一1．5奴，由天津医科大学动物实验中心提供。空气栓塞处死后取腰段脊柱椎间盘组织，参照文献[2]介绍的方法行类软骨细胞原代植块法培养。待类软骨细胞95％融合时，以O．25％胰蛋白酶传代分瓶。首次传代后随机分为3组(n=6)：I组一Ⅲ组。I组加入200m生理盐水，Ⅱ组和Ⅲ组分别加入400、800U／ml的胶原蛋白酶200m。置于5％C0237℃恒温培养箱，孵育24、48h和1周时在Olympus相差显微镜下观察细胞形态学。类软骨细胞出现非贴壁的悬浮状态或者贴壁后呈现细胞固缩，细胞失去光泽，胞浆突缩短。胞膜破裂为阳性细胞。随机选取10个

4、完整且不重叠的视野，计数阳性细胞，取平均值，计算阳性细胞率。统计学处理采用SPSS统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差(i±8)，组间比较采用重复测量设计的方差分析，P<0．05为差异有统计学意义。D01：10．3760／cma．j．iam．02．54-1416．2010．04．039作者单位：300211天津医科大学第二医院疼痛科通信作者：郑宝森。Email：zhengbaoaen-tj@163．Ⅲ·疼痛诊疗与研究·结果各组均为正常培养，未见细胞污染等发生。与I组和Ⅱ组比较，Ⅲ组阳性细胞率明显增加(P

5、>O．05)。表l各组兔不同时点阳性细胞率的比较(％，i±s)注：与I组比较，‘P(0．05与Ⅱ组比较，“P<0．05I组和Ⅱ组孵育24h时高倍镜下可见细胞密度稀疏，细胞间隙较大，大多数类软骨细胞贴壁形成单层细胞，形态各异，可呈三角形、多角形、梭形及不规则形，细胞排列无序；孵育48h时，细胞密度增加，细胞间隙缩小，但仍较为稀疏，细胞形态与孵育24h时无差异；孵育1周时，类软骨细胞呈密集生长状态，细胞密度增加明显，细胞间隙几乎不存在，绝大多数细胞形态呈单一梭形，未观察到三角形、多角形或者不规则形，细胞排列规律有序，沿长轴方向平行排列。Ⅲ组孵育24h时低倍镜下可见大多数

6、类软骨细胞处于非贴壁状态，细胞形成簇状群，高倍镜下可见类软骨细胞膜破裂，细胞分解为坏死颗粒状。讨论胶原蛋白酶溶解椎间盘组织突出物时临床常用浓度为400U／ml，因此本研究以该浓度为基准而设定了400和800U／ml两个浓度。并结合f临床上患者症状改善较明显的3个时间点：治疗后24h、铝b和1周来研究胶原蛋白酶对椎问盘类软骨细胞的影响。本研究中因Ⅲ组类软骨细胞在孵育24h时即表现为明显的细胞膜破坏和细胞崩解，因此观察孵育48h和1周时的细胞形态学和阳性细胞计数无意义，未进行观察。本研究结果表明，400U／ml的胶原蛋白酶对单层类软骨细胞无明显形态学影响，提示该浓度范围

7、内胶原蛋白酶对体外培养的单层细胞的胞膜未产生破坏作用，不影响细胞生长。胶原蛋白酶作用的底物为胶原纤维。胶原蛋白酶被注射到椎间盘组织内或者周围时，椎间盘组织中胶原纤维溶解，使得其中的类软骨细胞失去了胶原纤维的支撑而间接使类软骨细胞发生变性或者坏死。本研究结果亦表明，800U／ml的胶原蛋白酶对单层类软万方数据生堡盎醛堂茎查垫!!笙堡旦釜塑鲞笺!塑垡垡!』生堕蛔堂：叁趔!垫!!：!些：塑：№：!骨细胞孵育24h内即可造成明显损伤，导致细胞坏死，提示当胶原蛋白酶的浓度增加到一定程度时，可对单层培养的类软骨细胞的胞膜造成直接损伤。具体机理尚有待进一步研究。推测过高浓度的