兔椎间盘软骨终板细胞培养及其退变形态学和生物学特征的研究

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1、第四届全国解剖与临床学术研讨会暨‘解剖与临床》杂志创刊lO周年庆祝会论文汇编兔椎间盘软骨终板细胞培养及其退变形态学和生物学特征的研究屈开钛徐永清王非成都军区昆明总医院骨科昆明650032【摘要】目的：观察研究兔椎间盘软骨终板的细胞形态及表征，利用正常动物的体细胞传代培养发生功能退变的原理，制作软骨终板细胞体外培养的退变模型。方法：酶消化法培养兔椎间盘软骨一终扳细胞，并用HE和甲苯蓝染色，进行光镜观察；使用免疫组化法检测椎间盘的特征性II型胶原表达情况，与同种动物不同部位的软骨细胞做对照。结果：镜下观察，HE染色见细胞

2、呈多角形，核为圆形或椭圆形，有时见双核，胞浆内可见空泡。甲苯胺蓝染色可见胞浆及细胞周闱有紫红色或红色异染出现。原代细胞与传代细胞之间，形态结构无明显差异，但多次传代后(4代)，细胞则逐渐火去其原有形态，变为短梭型细胞，失去分化特性，表达II型胶原的量逐渐减少。软骨关节细胞与终板细胞形态学相似。结论：本研究提示(1)软骨终板细胞可表达其特征性产物蛋白多糖和II型胶原；(2)软骨终板细胞在培养时有逐渐退变，失去分化特性的特点，(3)在应用平面培养体系时应选用前3代细胞进行实验。以上几点均为椎间盘退变机理研究提供了细胞学基

3、础。1具体方法1．1主要试剂和器材试剂：1，9--"甲基Ⅱ甲蓝，II型胶原酶(Gibaco)，DMEM／H锄s—F12(四季青)。器材：倒置相差显微镜，高速低温离心机，血球计数极，50mi离心管，25cm2的培养瓶，24孔培养板等。1．2兔终板软骨细胞的取材和分离纯化方法取1月龄幼兔5只空气栓塞处死，常规手术消毒铺巾后取出兔整段腰椎，予无菌台上解剖山椎间盘及周同椎体后浸入lOOU／ml链霉素的培养基中进行清洗。之后置于消毒灭菌后的4倍解剖显微镜下，予椎间盘中份切开椎间盘，剔除髓核，刚眼科剪尽量剪除纤维环后，再用手术刀

4、沿椎骨缘下取’卜剩余的椎间盘。由于兔软骨终板比较薄，在取材时如果不小心操作的话，很容易将椎间盘中的其他结构(如纤维环)当作终板取下。我们在实验中主要采取了如下两个步骤米避免取材的失误。1．在大体中切断椎体后，将切断的椎体迮带中间的完整椎间盘浸入lOOU／ml链霉素的培养基中进行清洗，5分钟后取出，置于消毒灭菌后的4倍解剖显微镜下，于椎间盘中份切开椎间盘，剔除髓核，用眼科剪尽量剪除纤维环后，再刚手术刀沿椎骨缘下取下剩余的椎问盘。2．将剩余的椎间盘放入4cm直径的培养皿中，用手术刀切成lmm2大小的方块，再放入0．25％

5、的II型胶原酶37℃下消化2次，每次15分钟，以将残留的纤维环消化下来为标准，得到的基本上就是终板细胞了。而后经DMEM液稀释、200目钢丝网过滤组织块后得到细胞悬液。将得到的细胞悬液800r／min离心5分钟，去除沉在底层的血球等杂质，之后反复吹打，得到比较纯净的软骨终板细胞恳液。1．3软骨细胞培养取所需量的原代软骨终板细胞悬液，经适当稀释后，以3X104／cm2的密度、含100mL／L胎牛血清、584mg／L谷氨酰胺、0．1mmol／L--IF-必需氨墓酸、0．4retool／1脯氨酸、50ug／1维生索C的DM

6、EM／Ham’s-F12培养液接种于24孔板内，置于37"C，596CQ!培养箱内培养，定时换液。倒置显微镜下观察原267第四届全国解剖与临床学术研讨会暨‘解剖与临床》杂志创刊10周年庆祝会论文汇编代80％融合时进行传代培养，膝关节软骨细胞培养方法同上。1．4绘制细胞生长曲线选取70％融合、生长良好的原代终板、膝关节软骨细胞及第3代终板细胞，用胰酶消化，制成细胞悬液，行细胞记数，调整细胞浓度为1X104／ml，接种于96孔板内，每孔Iml，每2天换液1次，每天取3个培养孔的细胞进行计数，计算均值，连续观察16天，以培

7、养时间为横轴、细胞数为纵轴，描绘细胞生长曲线。1．5甲苯胺蓝年qlHE染色将细胞以2x104个／m1密度按种于预置有盖玻璃片的24孔板中，待细胞80％融合后，加入4％多聚甲醛溶液中4℃下，同定20min，分别做HE染色和甲苯胺监染色，镜下观察。1．6II型胶原免疫组化1．6．1主要试剂：鼠抗人单克隆抗体(迈新)，PV-9000步骤：采用PV-9000-"步法检测II型胶原。3％H2O2室温下孵育lOmin，热修复30rain，一抗鼠抗人单克隆抗体4℃过夜，PV-9000试剂l室温下孵育20rain，PV-9000试剂

8、2室温下孵育30min，DAB显色后，申性树胶封片。1．6．2阳性结果判断：阳性对照采用已知阳性切片，阴性对照采用PBS替代一抗。染色阳性表达为棕黄色，无着色为阴性。2结果2．1软骨细胞生长情况：倒置显微镜下观察，刚分离的软骨终板细胞为球形，具有折光性：细胞244,时后逐渐开始贴壁，逐渐伸展为多角形，胞核犬而圆，有些具有2个核f，胞浆丰富，内含